节杆菌BT801N-氨甲酰氨基酸水解酶基因的克隆与表达

通过PCR从质粒pUC18 16 9中扩增得到N 氨甲酰氨基酸水解酶基因 (hyuC) ,置于原核表达载体pQE6 0的T5启动子下游构成表达质粒pQE6 0 hyuC ,并在大肠杆菌M15中实现了该基因的高表达。SDS PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 44kD处有一表达带 ,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的 40 % ,主要以可溶性形式存在。酶活性分析结果表明 ,工程菌M15 pQE6 0 hyuC的N 氨甲酰氨基酸水解酶的比活分别比原始菌株ArthrobacterBT80 1和亚克隆DH5α pUC18 16 9提高了 5 2倍和 72倍。在节杆菌BT80 1和大肠杆菌DH5α pUC18 16 9的反应体系中加入等量菌体的工程菌M15 pQE6 0 hyuC ,可使乙内酰脲酶总比活分别提高 8 1倍和 3 0倍。

二甲基精氨酸二甲基氨基酸水解酶基因多态性与冠心病的相关性研究

目的:研究中国人群二甲基精氨酸二甲基氨基酸水解酶(DDAH)基因单核苷酸多态性(SNP)与冠状动脉性心脏病(coronary heart disease,CHD)的关系。方法:从山西医科大学第二医院选取冠心病患者165例和匹配的对照组192例。并记录所有研究对象的病史、体格检查等临床资料及其它流行病学资料,采取聚合酶链式反应和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测各组DDAH2基因rs805305位点C/G的基因型并统计各组的基因型频率。用连接酶检测反应(LDR)-测序分型方法检测各组基因rs2272592位点G/A的基因型并统计各组的基因型频率。结果:冠心病组rs805305和rs2272592基因型频率与对照组之间相比较均无显著差异(P>0.05)。并在校正了年龄、性别、高血压史、糖尿病史、甘油三酯和胆固醇等传统危险因素的影响后,这种相关性依然不存在。结论:DDAH2基因rs805305位点C/G多态性和rs2272592位点G/A多态性可能与中国人群冠心病发病不相关。

高活力固定化酰化氨基酸水解酶的制备及其在L-氨基酸和D-氨基酸生产中的应用

从药用淀汾酶(酶源:米曲霉602)制备固定化酰化氨基酸水解酶,20000μmol 甲硫氨酸^(**)/h/g 固定化酶。酰化氨基酸水解酶活力的回收率96%。固定化酶作用的最适 pH 为7.0。Fe^(2+)、Hg^(2+)和PCMB 抑制酶活力,Co^(2+)可提高活力40%。活力的半衰期为重复使用50次。制备的光学和层析纯 L-和 D-型色氨酸^(**),产率为64～72%。于酶反应液中加与 Co^(2+)等摩尔的 EDTA,用 CuSO_4滴定酶活力。方法简易快速。结果与茚三酮显色法的相符。

N-氨甲酰基氨基酸水解酶在毕赤酵母中的表达

N-氨甲酰氨基酸水解酶是乙内酰脲酶系的组成部分,催化N-氨甲酰氨基酸水解为相应氨基酸。节杆菌BT801的N-氨甲酰氨基酸水解酶是该菌乙内酰脲酶系中惟一具立体专一性的酶,也是整个反应体系的限速酶。通过PCR从携带乙内酰脲酶系完整操纵子的亚克隆质粒pUC18-169上扩增得到N-氨甲酰氨基酸水解酶基因(hyuC)片段,连接到载体pPIC3.5K上,经BglⅡ酶切线性化,通过PEG法转化导入毕赤酵母GS115感受态细胞,利用G418抗性筛选得到插入多拷贝目的基因的转化子。酶活性分析表明所得转化子具有N-氨甲酰氨基酸水解酶活性,可将N-氨甲酰基苯丙氨酸水解为苯丙氨酸。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的快速纯化及性质

通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析及阴离子交换层析等三步 ,有效地从一菌株NO .2 2 6 2中纯化了N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶。结果表明 ,酶活性回收约 2 0 %,纯化了 8 4倍。天然PAGE与SDS PAGE分析表明 ,该酶分子为同源四聚体 ,单体分子量约为 3 5kD。酶催化反应的最适pH为 7 7～ 8 0 ,最适温度为 45℃。以N 氨甲酰 DL 丙氨酸为底物时 ,Km =1 3×1 0 - 3 mol L ,Vmax=0 .3 3mol min。二价金属离子Ni2 + 有激活作用 ,Zn2 + 有明显的抑制作用 ,而Co2 + 对酶活无影响。该酶N 末端 8个氨基酸残基依次为TRQKILAF。

α-氨基酸酯水解酶突变体催化合成头孢丙烯

目的通过α-氨基酸酯水解酶突变体合成头孢丙烯的工艺条件实验,获得相关实验数据,为推行头孢丙烯的绿色生产技术打下基础。方法通过定向进化对野生型α-氨基酸酯水解酶进行改造,用突变体酶催化合成头孢丙烯,考察了包括pH、温度、酶浓度、母核/侧链投料比及有机溶剂等多个因素对酶法合成头孢丙烯的影响。结果对野生型AEH酶进行分子改造,筛选出一株突变体。动力学数据分析表明,突变体酶比野生型更适合用于头孢丙烯的合成。在突变体酶催化合成头孢丙烯的过程中,体系最适合的pH为6.0;最适温度为30℃;底物浓度为50mmol/L;最适的母核侧链比为1:2;最适的反应体系为15%异丙醇-水溶液。结论相对于野生型的α-氨基酸酯水解酶,该突变体更适合用于头孢丙烯的合成,实验数据为头孢丙烯酶法合成的实际应用打下基础。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶基因的克隆与表达

按本室纯化的N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶 (DCase)的N 末端氨基酸序列设计了正向引物 ,并在已报道的不同来源菌株DCase的氨基酸序列同源性分析的基础上 ,设计了反向引物。用菌株No . 2 2 62总DNA为模板 ,经PCR扩增获得长度为约0 9kpb的片段 ,DNA序列分析表明基因全长为 912bp。将该片段插入 pET 3a ,构建成重组子 pET DCase ,并在E coliDH5α中获得表达 ,经SDS PAGE检测 ,表达产物分子量与天然纯DCase相同 ,约为 35kD。

N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的融合表达、纯化和酶活性

将菌株SS-ori的N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因(DCase)插入到pMAL-c2X载体中,构建表达产物为麦芽糖结合蛋白(MBP)与DCase融合的重组子。该重组子在E.coliBL21中的表达产物为融合蛋白MBP-DCase(76.4ka),光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的19%。经Amy-lose亲和纯化和Superose12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X的背景,用FactorXa剪切后,可得约41.7ka的MBP和34.7ka的DCase。酶活性检测表明当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸做为底物,A600=10时,每升菌体每小时可产生D-缬氨酸0.78g。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶生产菌的选育

以产N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的恶臭假单胞菌MZ0315为出发菌株,应用紫外和硫酸二乙酯的复合诱变,经底物类似物5-氟尿嘧啶的筛选,获得高产、稳定的优良菌株MF0506。经过发酵培养基优化,诱变株的产酶活力由出发菌株的0.443u/ml提高至0.680u/ml。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的固定化工艺

以TJS环氧基树脂作为载体对N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶进行固定化,最佳工艺条件为:1g树脂载体大约对应133U酶液,蛋白质量浓度0.35mg/mL,固定时间15h,温度28℃,pH7.5,固定化酶活达到58.5U。蛋白固定率可达97.4%,酶活回收率达到49.3%,得到的固定化酶使用半衰期达到26批。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶研究进展

用生物转化法生产D 氨基酸已经成为国内外半合成抗生素行业的支柱之一。此外 ,D 氨基酸及其衍生物还是甜味剂、拟除虫菊脂、多肽激素等诸多产品的重要中间体。介绍D 氨基酸生物转化中N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶的一些生化性质。

重组大肠杆菌共表达D-海因酶和N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶

通过PCR分别扩增得到N-carbamoylase基因和上游带有RBS区的D-hydantoinase基因,并将其依次克隆入pBAD/HisA质粒中,得到呈多顺反子结构的双酶表达质粒pBAD-CRH,转化E.coliTop10F′得到重组菌TaraCRH.实验证明,E.coliTaraCRH对外源蛋白的表达控制严紧,而加入阿拉伯糖诱导后可以成功表达两酶基因.诱导条件优化结果表明,诱导温度采用29℃,培养基中阿拉伯糖浓度0.05g/L可达到最高酶活.进一步尝试采用玉米浆培养基代替LB培养基,在经过优化的玉米浆培养基中培养TaraCRH菌株,经阿拉伯糖诱导,海因酶和水解酶酶活分别达到3.52和4.21U/mL.

假单胞菌菌株ON-4a中的一个新型N—氨基甲酰—L—氨基酸酰胺水解酶：在大肠杆菌中表达的N—氨基甲酰—L—半胱氨酸酰胺水解酶的纯化和特性研究 Ohmachi T等[Appl microbiol biotechnol，2004，65（6）：686．693]

从表达编码假单胞菌菌株ON-4a的N-氨基甲酰-L-半胱氨酸(NCC)酰胺水解酶基因的大肠杆菌的粗提物中纯化了NCC酰胺水解酶并进行了特性研究。用三步柱色谱将该酶纯化58倍达到同质，收率为16．1％。在交联葡聚糖S-300上的凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果表明该酶是同一45kD的亚单位的四聚物蛋白。酶活性的最适pH和温度分别为9．0和50℃。

DCase水解酶固定化的性质

以TJS环氧基树脂作为载体,对N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶进行固定化研究。最佳工艺条件如下:1 g树脂载体大约对应133 U酶液,蛋白质量浓度为0.35 mg/mL,固定时间为15h,温度为28℃,pH值为7.5,固定化酶活力达到58.5 U·g^(-1),固定率可达97.4%,酶活回收率达到49.3%,固定化酶活半衰期长达14 d。

α-氨基酸酯水解酶合成头孢克洛

用实验室自制的α-氨基酸酯水解酶(AEH)催化合成了头孢克洛。考察了pH值、温度、酶浓度、7-ACCA/D-PGM·HCl投料比、有机溶剂和D-PGM·HCl流加方式等多个因素对该反应的影响。所得最优工艺组合为:pH 6.1,温度15℃,7-ACCA浓度100 mmol/L,投料比1∶1.3,反应体系含25%乙醇,加料方式为侧链流加。优化工艺后头孢克洛的转化率达80%以上,为其酶法合成的进一步发展提供了参考。

全细胞高通量筛选α-氨基酸酯水解酶突变体的方法

【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的α-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线。采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定α-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与△A340?405在(0.1?0.6)×10?3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系,服从朗伯-比尔定律,平均回收率为99.8%?101.3%。一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选,获得3株kcat提高40%以上,4株半失活温度较野生型提高5°C以上的突变体酶。【结论】该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应,达到高通量筛选的要求。

红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高

【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。

重组α-氨基酸酯水解酶合成头孢曲嗪

为了探索酶法合成头孢曲嗪的产业化工艺路线,从红纹黄单胞菌Xanthomonas rubrillineans中克隆-氨基酸酯水解酶基因全序列,转化入大肠杆菌中表达。以头孢曲嗪的合成转化率为指标,分别考察纯化的重组-氨基酸酯水解酶合成头孢曲嗪的最适温度、最适pH和最佳底物摩尔比。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,重组-氨基酸酯水解酶的单体分子量为70 kDa。催化合成头孢曲嗪的最适pH为(6.0±0.1),最适温度为36℃。底物浓度约为7-ATTC 30 mmol/L、HPGM HCl 120 mmol/L,酶用量22 U/mL时,头孢曲嗪的转化率达到64.3%。结果为优化酶法合成头孢曲嗪的产业化工艺奠定了基础。

红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的分离纯化及酶学性质

【目的】从红纹黄单胞菌中分离纯化了胞内α-氨基酸酯水解酶(AEH),并进行了酶学性质研究。【方法】采用乙酸丁酯破碎细胞,并相继用磷酸钙凝胶沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-50阴离子交换处理、CM Cellulose 52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析纯化得到了电泳纯α-氨基酸酯水解酶,并研究了此酶的酶学性质。【结果】SDS-PAGE显示α-氨基酸酯水解酶的亚基分子量为70 kDa。酶促合成头孢克洛的最适pH为6.8,最适温度为42℃,在pH5.0-8.0和35℃以下,酶保持了良好的稳定性。Mn2+和Ca2+对酶活有一定的促进作用,Cu2+、Fe2+及高浓度的丙酮对酶活有强的抑制作用。AEH催化D-苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯和头孢克洛水解反应的kcat/Km分别为123.7±3.7 mmol-1.s-1.L、2.9±0.6 mmol-1.s-1.L和101.3±2.1 mmol-1.s-1.L,AEH对D-苯甘氨酸甲酯的催化效率最高。AEH催化双底物反应的机制为乒乓机制,催化合成头孢克洛的kcat为547.3±38.2 s-1。【结论】有关红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的酶学性质研究相对较少,本文的研究将为该酶催化合成β-内酰胺类抗生素的工业化应用提供重要参数。

α-氨基酸酯水解酶酶促合成β-内酰胺类抗生素的研究进展

β-内酰胺类抗生素是临床应用最为广泛的一类抗感染药物,在我国医药工业中占有十分重要的地位。由于β-内酰胺类抗生素的酶法合成比传统化学法更节能环保、经济,国外已有企业开始大规模应用酶法合成工艺。加强酶法合成β-内酰胺类抗生素研究对于我国医药产业具有十分重要的现实意义。本文主要综述了α-氨基酸酯水解酶的研究进展,并展望它在合成β-内酰胺类抗生素中的应用。