聚合酶链式反应检测酒酒球菌氨基酸脱羧酶基因

利用聚合酶链式反应(PCR)和多重PCR方法,采用3对特异性引物,检测40株酒酒球菌基因组中是否含有组氨酸脱羧酶基因(hdc基因)、酪氨酸脱羧酶基因(tdc基因)和鸟氨酸脱羧酶基因(odc基因)。结果表明:40株酒酒球菌基因组中有33株酒酒球菌含有组氨酸脱羧酶,22株酒酒球菌含有酪氨酸脱羧酶,16菌株含有鸟氨酸脱羧酶。建立的PCR法可快捷、高度特异地检测酒酒球菌中含有的hdc基因、tdc基因和odc基因。

人芳香族氨基酸脱羧酶基因的克隆及测序

【目的】用RT PCR法获得人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶 (AADC)基因全序列 ,并建立优化方法。【方法】从人嗜铬细胞瘤中提取组织总RNA ,自行设计引物 ,采用两步RT PCR法扩增出长约 15 5 0bp的基因片断 ,凝胶回收后与高效克隆PCR产物的新型载体T 载体连接 ,并转化入大肠杆菌 ,通过蓝白斑反应筛选出重组体 ,质粒提取后进行重组体的酶切鉴定及基因测序。【结果】BamHⅠ和HindⅢ酶切证实了目的基因同克隆载体进行了有效的连接 ,基因测序证实了所克隆的片断为人AADC基因。【结论】本实验通过对引物 ,Taq酶的选择及反应条件的优化 ,保证了扩增的有效性和特异性。新型的克隆载体明显提高了克隆效率。基因测序证实了AADC基因扩增的成功。本研究为AADC基因治疗帕金森病等多巴胺能缺乏疾病的研究打下了基础。

芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症2例报告及文献复习

目的报道芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症(AADCD)患儿的临床表现及基因特征。方法分析2例AADCD患儿的临床资料及基因结果,并复习相关文献。结果2例女性患儿,均为新生儿期起病,表现为喂养困难、运动发育落后、眼球震颤、痉挛发作。2例患儿均于1岁余行基因检测,发现DDC基因第13外显子的杂合突变c.1234C>T,例1来源于母亲,例2来源于父亲;同时例1和例2也均携带新的杂合突变c.170A>G(p.I57T)和c.179T>C(p.V60A),临床意义不明。结论2例AADCD患儿均有典型临床表现,早期基因检测识别确诊有助于改善预后。

芳香族氨基酸脱羧酶及其与帕金森病基因治疗的关系

帕金森病 (PD)是一种以黑质纹状体多巴胺能神经元减少为特征的疾病 ,给予左旋多巴可以提高帕金森病人脑内纹状体多巴胺的水平。芳香族氨基酸脱羧酶 (AADC)在脑内多巴胺神经递质合成过程中将L -DOPA转换成为多巴胺 ,它在基因表达和蛋白活性上分别受到调节。PD病程中 ,与L -DOPA的波动相关的AADC基因调节对疾病的治疗有重要作用。

酪氨酸羟化酶和左旋芳香族氨基酸脱羧酶基因的细胞表达及活性检测

由于在帕金森病中合成多巴胺所需的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和左旋芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase,AADC)活性明显降低,所以补充多巴胺合成酶成为基因治疗帕金森病研究的主要手段。我们分别构建了重组逆转录病毒载体pLHCX/TH及pLNCX_2/AADC,通过脂质体介导将带有目的基因的载体分别转到包装细胞PA317中,经筛选得到产病毒的细胞PA317/TH和PA317/AADC,采用免疫组化、原位杂交方法检测目的基因表达;细胞经裂解后进行的酶促反应产物多巴胺以高压液相电化学方法检测证明所克隆的TH及AADC基因具有功能活性;这两种基因工程改造细胞可以完成酶促动力学的功能,使L-dopa及多巴胺产生明显增加。本研究为用TH和AADC双基因对帕金森病进行基因治疗提供了一定的依据。

一种快速定量检测氨基酸脱羧酶活力的比色方法及其应用

本试验旨在探究一种快速定量检测氨基酸脱羧酶活力的比色方法。试验采用脱羧酶标准品进行标准曲线的制备,再用待测样品的吸光度值和标准曲线计算样品氨基酸脱羧酶活力。采用本试验建立的检测氨基酸脱羧酶活力的比色方法,对猪结肠微生物和脑组织样品进行氨基酸脱羧酶活力的测定;通过对未知样品的氨基酸脱羧酶活力进行测定,验证该方法的准确性。结果显示:以酪氨酸脱羧酶标准品建立了线性关系较好的氨基酸脱羧酶活力标准曲线:y=0.4789 x+0.1126,R 2=0.9980。不同氨基酸脱羧酶活力与构建的酪氨酸脱羧酶活力标准曲线相似度高,说明本方法对多种氨基酸脱羧酶活力有广泛的适用性。采用本试验建立的比色方法快速地测定出了猪结肠微生物和脑组织中氨基酸脱羧酶活力;并且,使用该方法测得的未知样品的氨基酸脱羧酶活力落入已构建的标准曲线范围中,说明本方法的准确性较高。由结果可知,本试验建立的比色方法是检测氨基酸脱羧酶活力的一种快速方法,成本低廉,操作简单,对仪器要求不高,方法可靠,适用于多种样品中氨基酸脱羧酶活力的测定,可为研究动物组织、微生物培养液、细胞培养以及血液样本中的氨基酸脱羧酶活力提供有效的测定方法。

氨基酸脱羧酶微量快速试验方法的研究

研制氨基酸脱羧酶微量快速试验培养基用于肠道致病菌的检验。经过接种132株细菌的试验结果证明,氨基酸脱羧酶微量快速试验与常规单管试验进行对比所得结果完全一致。培养基制备简单,性能稳定,试验速度快而且敏感性高,有一定的推广应用价值。

芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症1例报告及文献复习

芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症(aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency,AADCD)是因DDC基因纯合或复合杂合突变引起的罕见且严重的常染色体隐性神经发育障碍疾病,该疾病的临床特征为婴儿期起病的肌张力低下,精神运动迟缓,动眼危象,自主神经功能紊乱。国内相关报道少见。现对我院收治的1例AADCD患儿的临床及遗传学特点进行总结,并进行文献复习,报告如下。

芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症一家系临床表现及遗传学分析

目的探讨芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症(AADCD)的临床表型及遗传学特点。方法回顾分析1个AADCD家系的临床资料,并复习相关文献。结果家系中2例同胞兄弟均在3月龄发病,主要表现为动眼危象、发育迟缓、肌张力低下、多汗。全外显子测序检测到患儿DDC基因c.714+4(IVS 6)A>T和c.1234(exon 13)C>T复合杂合变异,前者来源于父亲,后者来源于母亲。结论DDC基因c.714+4(IVS 6)A>T和c.1234(exon 13)C>T复合杂合变异的AADCD临床表型常为重型、发病早。

氨基酸脱羧酶的发酵罐培养

一、前言随着氨基酸工业的发展,谷氨酸钠年产量在50万吨以上,赖氨酸盐酸盐年产量在40万吨以上,氨基酸脱羧酶的应用日益广泛,但工厂用于生产测定所需的脱羧酶均系在试验室规模由摇瓶或茄子瓶培养,不但工作量大,而且收率不高。在发酵罐中生产尚未见报导。本文仅就150升发酵罐的培养过程进行分析与讨论。

1-甲基环丙烯处理(1-MCP)对南果梨酯类物质、氨基酸及相关代谢酶的影响

以南果梨为材料,研究1-MCP处理对南果梨酯类物质、氨基酸含量及其代谢相关酶:醇脱氢酶(ADH)、醇酰基转移酶(AAT)和丙酮酸脱羧酶(PDC)活性变化的影响。结果表明:经1-MCP处理的果实酯类物质相对含量高峰值出现的时间延后15d,而且酯类物质的种类较对照果实减少了27.3%;处理的果实中15种游离氨基酸总量明显降低;1-MCP处理对果实AAT酶和PDC酶活性有明显的抑制作用,而对ADH酶活性的影响不明显。由此可见,1-MCP处理影响以氨基酸为前体物合成酯类物质的正常代谢过程,从而使南果梨在采后后熟过程中特有的香气变淡。

利用假单胞菌天冬氨酸-β-脱羧酶高效生产L-丙氨酸

通过诱变筛选得到一株具有高活性Ｌ－Ａｓｐ－β－脱羧酶的菌株ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＮＸ－１，对该株酶形成和酶反应的条件进行了详细研究，该株可以高效地转化Ｌ－Ａｓｐ生成Ｌ－ＡＩａ，转化４～５山每Ｌ培养液可转化Ｌ－Ａｓｐ量高达１４００ｇ左右，生成Ｌ－Ａｌａ浓度高达９０％以上，摩尔转化率近１００％。

臭鳜鱼中氨基酸产生菌的分离鉴定及其加工特性评价

针对我国传统臭鳜鱼制品存在风味稳定性差、安全性低等问题,采用传统微生物培养技术,在自然发酵臭鳜鱼中分离获得菌株,通过薄层层析法(thin-layer chromatograph, TLC)初步筛选获得10株产氨基酸菌株,测定菌株上清液中游离氨基氮总量,复筛获得1株优良氨基酸产生菌L2-2,经16S rRNA序列分析对其进行鉴定,并通过耐盐试验、氨基酸脱羧酶试验和抑菌试验确定菌株的加工特性。经鉴定菌株L2-2为清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei),其耐盐特性较好,精氨酸脱羧酶呈阳性;对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制活性。

猪肠道微生物对不同分子结构蛋白质饲料源氨基酸消失率的差异性

本试验旨在研究猪肠道微生物对不同分子结构蛋白质饲料源(大豆蛋白质、大豆肽、单体氨基酸)氨基酸消失率的差异性。选取3头30 kg左右的健康生长猪,屠宰后分别无菌取50 mL空肠、回肠和盲肠内容物置于500 mL厌氧基础培养基中,梯度离心获得相应肠道微生物悬混液。在250 mL锥形瓶中加入50 mL厌氧基础培养基,先取5 mL空肠微生物悬混液接种于50 mL预热的培养基中培养4 h后取5mL培养液用于氨基酸含量和酶活性测定,再加入5 mL回肠微生物悬混液继续培养4 h后取5 mL培养液用于氨基酸含量和酶活性测定,最后加入5 mL盲肠微生物悬混液继续培养4 h后取5 mL培养液用于氨基酸含量和酶活性测定。试验分为3组,分别为大豆蛋白质组(基础培养基+大豆蛋白质+微生物)、大豆肽组(基础培养基+大豆肽+微生物)和单体氨基酸组(基础培养基+单体氨基酸+微生物),另设1个负对照组(基础培养基+微生物),3个正对照组(基础培养基+大豆蛋白质、基础培养基+大豆肽和基础培养基+单体氨基酸),每组设3个重复。结果表明:空肠、回肠、盲肠中微生物对3种不同分子结构蛋白质饲料源的赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、组氨酸脱羧酶、甘氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶和腺苷脱氨酶活性均有显著或极显著影响(P<0.05或P<0.01),单体氨基酸组酶活性整体上高于其他2组,3组间酶活性大小与氨基酸的消失率高低并不完全一致。不同分子结构蛋白质饲料源在加入不同肠道的微生物培养后氨基酸消失率存在极显著差异(P<0.01)。大豆蛋白质组的氨基酸消失率由高到低依次为:盲肠、空肠、回肠,结构较为简单的大豆肽组和单体氨基酸组的氨基酸消失率由高到低依次为:回肠、盲肠、空肠,大豆蛋白质组的总氨基酸消失率最高。综上,在肠道微生物体外培养下,3种不同分子结构形式的蛋白质饲料源之间氨基酸的消失率存在较大差异,肠道微生物对大豆蛋白质的分解更活跃。

猪肠道微生物对饲料源氨基酸消失率的影响

试验旨在研究猪肠道微生物对饲料源氨基酸消失率的影响。选取3头30 kg左右的生长猪,屠宰后无菌取空肠、回肠和盲肠内容物悬液。在含豆粕、棉粕、菜粕、鱼粉的厌氧基础培养基中,于0、4、8 h依次接种空肠、回肠和盲肠内容物悬液,于4、8、12 h取培养液测定氨基酸含量及酶活力。结果表明:在空肠与回肠微生物作用下各组的氨基酸消失率较低,在盲肠微生物作用下的氨基酸消失率最高;在盲肠微生物作用下,豆粕组天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、组氨酸消失率显著低于其他3组;除半胱氨酸、缬氨酸、精氨酸以外,棉粕组的其他氨基酸都显著高于豆粕组而低于鱼粉组;鱼粉组除了半胱氨酸和精氨酸外,其他氨基酸消失率都显著低于菜粕组而高于棉粕组和豆粕组;菜粕组除了半胱氨酸和精氨酸外其他氨基酸消失率都显著高于其他3组。在体外培养时,猪肠道微生物对豆粕、棉粕、菜粕、鱼粉氨基酸消失率具有差异性,对菜粕组氨基酸的消失率影响最大,鱼粉、菜粕次之,豆粕最小。

大鼠脊髓全横断诱导芳香族氨基酸脱酸酶细胞产生5-羟色胺的机制研究

目的:探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)前后芳香族氨基酸脱酸酶(Aromatic L-amino acid decarboxylase,AADC)细胞的分布以及SCI后不同时间段AADC细胞表达5-羟色胺(5-HT)的特点。方法:60只成年雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(12只)、脊髓损伤2d组(24只,其中假手术/Sham组12只)及脊髓损伤60d组(24只,其中假手术/Sham组12只)。使用负压吸引器将大鼠T10-T11脊髓完全离断1~3mm,建立脊髓胸段T10-T11全横断模型。使用BBB评分评价SCI大鼠不同时间点后肢运动功能。各组大鼠在相应时间点灌注取材,并且在灌注前30min腹腔注射外源性5-羟色胺酸(5-HTP)(100mg/kg),免疫荧光法检测脊髓腰段(L段)和骶尾段(S+C段)中AADC和5-HT表达水平。结果:SCI大鼠在术后1~2、3、7、14、28、60d时BBB评分别为0、1.00±0.58、3.30±0.95、6.30±0.10、7.50±0.36、7.87±0.08分。AADC细胞主要在脊髓的背角、中间带、中央管周围等部位表达。正常对照组、脊髓损伤2d组和脊髓损伤60d组AADC表达数量在脊髓L段为:46.75±5.50、49.50±4.87、48.50±6.38个,在脊髓S+C段为1026.50±66.59、1066.75±80.56、1046.25±67.79个,三组结果相比无显著性差异(P>0.05)。正常对照组大鼠脊髓L段和S+C段中AADC细胞中未见5-HT的表达,但在SCI2d组和SCI 60d组均观察到AADC细胞表达5-HT,L段两组表达率分别为(44.43±6.03)%和(96.20±1.53)%,S+C段分别为(44.45±5.71)%和(95.14±3.02)%,两组间差异有显著性(P<0.05)。结论:AADC细胞在脊髓胸段T10~T11全横断损伤前后脊髓中表达数量和部位相似。SCI后,损伤平面以下脊髓中的AADC细胞功能增加,可利用外源性5-HTP生成5-HT。

采后苯并噻重氮处理对‘玉金香’甜瓜氨基酸代谢酯类香气物质及其代谢机理的影响

以‘玉金香’甜瓜为材料,采后常温贮藏期间分析其氨基酸含量、谷丙转氨酶(glutamate pyruvic transaminase,GPT)、谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)、丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)活力及其代谢产物酯类香气物质含量的变化,探讨采后苯并噻重氮(benzothiadiazole,BTH)诱抗处理对酯类香气物质氨基酸代谢途径影响的机理。结果表明:BTH诱抗处理可延迟样品酯类香气物质释放高峰出现,抑制其释放,总含量比CK组(未经任何处理)低19.10%。15种游离氨基酸被分离确定,CK组氨基酸总含量峰值(14 597μg/g)出现在第6天,BTH组峰值出现在第8天,低于CK组9.47%(P<0.05)。BTH处理抑制了贮藏期间GOT、PDC和PDH活力,与CK组相比,BTH处理组果皮GOT、PDC和PDH活力峰值分别降低31.80%、16.86%和24.30%,果肉峰值分别降低19.10%、14.70%和25.56%,果皮GOT活力被显著抑制(P<0.05);不同处理组间GPT活力差异不显著(P>0.05)。氨基酸总含量、GOT活力与酯类香气物质含量呈极显著正相关(P<0.01)。水处理对氨基酸含量、代谢酶活力及其产物酯类香气物质释放均有影响,但无明显作用规律。由此可见,BTH处理会减少氨基酸含量,抑制相关代谢酶活力,进而改变其产物酯类香气物质的释放。

芳香族氨基酸脱羧酶研究进展

芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylases,AADCs)在生物体内的作用是将芳香族氨基酸脱羧转化为芳香族单胺(aromatic monoamines),磷酸吡哆醛(pyridoxal 5'-phosphate,PLP)是其行使催化功能时必不可少的辅酶。AADCs催化芳香族氨基酸产生的芳香族单胺,主要包括多巴胺、血清素、酪胺、色胺等,这些芳香族单胺在生物体内是维持正常生理功能的神经递质,也是参与合成某些化合物的重要前体,还可作为药物中的活性成分参与治疗多种人类疾病,具有广阔的应用前景。作为生物合成芳香族单胺所必需的酶,有关AADCs的研究也越来越深入,基于AADCs的芳香族单胺生物合成也取得了长足进步。对几种主要AADCs进行综述,为AADCs更好应用于芳香族单胺的生物合成提供参考。

芳香族-L-氨基酸脱羧酶在脑缺血再灌注中的促凋亡作用及相关机制研究

目的观察脑缺血再灌注中芳香族-L-氨基酸脱羧酶(AADC)对凋亡的作用和与PI3K/Akt信号通路的关系。方法建立tMCAO大鼠和OGD/RPC12细胞模型,检测大脑皮层神经元和PC12细胞凋亡情况与AADC、PI3K/Akt信号通路及下游凋亡相关蛋白的表达情况。结果体内实验结果显示,皮层神经元受损时,模型组AADC蛋白表达水平显著上升(P<0.01)。体外实验结果显示,PC12细胞存活率降低时,AADC蛋白表达水平显著上升(P<0.01),PI3K显著下降(P<0.01),Bcl-2等抗凋亡蛋白降低,Caspase-3等促凋亡蛋白升高。沉默AADC可促进PC12细胞存活并使PI3K、Akt等抗凋亡蛋白表达增加,Caspase-3等促凋亡蛋白表达降低。结论AADC在CIRI中可通过抑制PI3K/Akt信号通路,影响下游Bcl-2、Caspase-3等凋亡相关蛋白表达诱发神经元凋亡。