L-精氨酸转运体-2的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建氨基酸转运体-2(CAT-2)的靶向小分子干扰RNA(siRNA)表达载体质粒,并测序鉴定,为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-argine/iNOS/NO通路的影响建立基础。方法:根据L-精氨酸转运体CAT-2的mRNA序列及siRNA设计原则,并经BLAST比对,设计合成4对siRNA寡聚单链DNA,退火成双链dsDNA,用载体构建试剂盒BLOCK-iTTMPol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP进行重组质粒构建,将4对dsDNA分别插入到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒,并转化至感受态细菌DH5。筛选阳性克隆并提取重组质粒后测序分析。结果:CAT-2的siRNA重组载体质粒测序结果证实表达载体构建成功。结论:L-精氨酸转运体CAT-2 siRNA表达载体质粒成功构建,为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-arg/iNOS/NO通路的影响建立基础。

氨基胍对内毒素活化小鼠巨噬细胞L-arginine转运及CAT-2表达影响的实验研究

目的:通过氨基胍(AG)干预内毒素活化小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,观察NO的产生、左旋精氨酸(L-Arg)转运以及碱性氨基酸转运体-2(CAT-2)mRNA的表达,旨在研究氨基胍对L-Arg跨膜转运及CAT-2表达的影响。方法:实验分为四组,即对照组,LPS对照组,AG组,AG+LPS组。接种RAW264.7细胞于培养板后,37℃、5%CO2培养箱培养24 h,将AG组和AG+LPS组换以含AG 1 mmol/L的DMEM培养液,30 min后四组均换以新鲜DMEM培养液,其中LPS对照组和AG+LPS组加入LPS,继续培养18 h,检测细胞合成NO水平、L-Arg摄取率和CAT-2 mRNA表达。结果:与对照组比较,AG预处理后的RAW264.7细胞,经LPS活化后NO水平、L-Arg摄取率、CAT-2 mRNA水平显著降低。结论:AG作为一种特异的诱生型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂,不仅可抑制iNOS的活性,而且还可以从基因水平上抑制L-Arg转运体CAT-2的表达,进而阻断L-Arg的跨膜转运和NO合成。