肠上皮细胞中性氨基酸载体B^0AT1的真核表达及稳定转染体系的建立

目的:构建可表达人中性氨基酸载体B0AT1基因的真核表达载体,建立重组质粒转染的Hela细胞系,筛选出稳定表达人B0AT1的细胞株。方法:提取人正常小肠上皮细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出B0AT1基因片段,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后,将其插入至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-B0AT1,转化E.coliDH5α菌株感受态细胞,将阳性克隆脂质体法转染Hela细胞,经G418筛选获得稳定表达株,用RT-PCR法检测B0AT1基因的mRNA表达。结果:从小肠上皮细胞中成功克隆到人B0AT1基因。酶切和序列测定表明已成功构建真核表达载体pcDNA3.1-B0AT1,将此重组质粒转染的Hela细胞,可稳定表达人B0AT1基因,并筛选出稳定表达B0AT1的Hela细胞系。氨基酸摄取实验证实,转染pcDNA3.1-B0AT1的Hela细胞具有B0AT1基因的生物学活性。结论:重组人中性氨基酸载体B0AT1克隆成功,并在Hela细胞中获得稳定表达。

严重创伤对肠上皮细胞中性氨基酸载体ASCT2表达的影响

目的：研究用肠上皮细胞系Caco-2定量分析在严重创伤情况下氨基酸的转运变化及其载体蛋白表达情况。方法：体外培养肠上皮细胞系Caco-2,首先分析其细胞膜表面Na^＋-依赖性中性氨基酸转运及其转运载体功能特性。将细胞置于缺氧、营养剥夺和缺血等创伤条件下,继续培养1-6 h,观察其刷状缘膜囊氨基酸转运及其相应转运载体蛋白及mRNA表达情况。结果：Caco-2细胞膜表面Na^＋-依赖性L-丙氨酸的转运速率,高于L-谷氨酰胺（876±67.5）pmol/mg蛋白·min^-1vs（635±52.8）pmol/mg蛋白·min^-1,P〈0.01）。在主要的中性氨基酸载体中,仅仅成功扩增出ASCT2的mRNA条带。与对照组相比,在营养剥夺及缺血条件下,L-丙氨酸和L-谷氨酰胺的转运速率明显下降（P〈0.01）,而缺氧对氨基酸转运无明显影响。这种变化主要引起转运动力学Vmax值下降,Km值无明显变化。与对照组相比,营养剥夺及缺血条件下相关转运载体蛋白及mRNA表达下降。结论：严重创伤对Na^＋-依赖性中性氨基酸转运及关键性转运载体调控特点不同。这对临床上危重症病人特殊的营养底物需求,可能提供积极的理论依据。

炎性痛-吗啡耐受大鼠背根神经节兴奋性氨基酸载体1的表达

目的探讨兴奋性氨基酸载体1（EAAC1）在吗啡耐受形成机制中的作用。方法将30只雄性SD大鼠行鞘内置管,随机均分为六组。其中的四组于左后肢制成佐剂性关节炎模型,分别经鞘内给予生理盐水（C组）、吗啡10μg（M10组）、吗啡20μg（M20组）、吗啡10μg＋纳洛酮10μg（MN组）;另外两组未致炎大鼠分别经鞘内给予生理盐水（C0组）、吗啡20μg（M0组）。各组给药均为1日2次,连续7 d。动态检测大鼠左后肢50%缩爪阈值,于给药后第8天测定痛阈后将大鼠处死,取左侧L3-4、L4-5节段背根神经节（DRG）进行免疫组织化学染色,检测DRG中EAAC1的表达。结果M10、M20两组在鞘内给予吗啡第8天形成较稳定的吗啡耐受,其DRG内EAAC1表达下调。结论DRG EAAC1参与炎性痛大鼠慢性吗啡耐受的形成机制。

肠黏膜刷状缘中性氨基酸载体ASCT2的结构和功能特点

ASCT2是肠黏膜刷状缘的一种Na+依赖性中性氨基酸载体,它的功能主要是转运中性氨基酸,如丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺等。对ASCT2分子结构、功能特点和调控特性等的研究,有助于对肠道功能的认识,并为临床短肠综合征(SBS)及其他肠功能障碍疾病提供新的治疗对策。

氨基酸转运载体相关基因在番鸭小肠不同肠段的表达分析

试验旨在研究氨基酸转运载体相关基因在番鸭小肠不同肠段的表达规律。试验测定90和300日龄公番鸭体重与小肠形态发育,采用RT-PCR比较氨基酸转运载体相关基因SLC1A1、SLC1A4、SLC7A1、SLC7A5和SLC7A9在90和300日龄公番鸭小肠不同肠段的表达量,并进行高、低体重组300日龄公番鸭回肠氨基酸转运载体相关基因表达的验证试验。结果显示:除回肠绒毛高度外,300日龄番鸭十二指肠、空肠和回肠的肠壁厚度、隐窝深度和绒毛宽度以及十二指肠和空肠的绒毛高度均显著高于90日龄(P<0.05);300日龄番鸭空肠和回肠的肠壁厚度显著高于十二指肠(P<0.05),90、300日龄番鸭十二指肠的绒毛高度和隐窝深度显著高于空肠和回肠(P<0.05);300日龄番鸭十二指肠和空肠SLC1A1mRNA表达量、十二指肠和回肠SLC7A5 mRNA表达量以及十二指肠、空肠和回肠SLC7A9 mRNA表达量均显著高于90日龄(P<0.05);300日龄番鸭回肠SLC1A1、SLC1A4、SLC7A5和SLC7A9 mRNA表达量显著高于空肠和十二指肠(P<0.05);高体重组番鸭SLC1A1mRNA表达量显著高于低体重组(P<0.05)。研究表明,番鸭肠道转运吸收氨基酸的主要部位是小肠后半段,SLC1A1基因可作为番鸭体重选择的候选功能基因。

鸡不同肠段碱性氨基酸转运载体mRNA表达的差异性研究

为研究肉鸡肠道不同肠段碱性氨基酸转运载体rBAT(系统b0,+)、y+LAT2(系统y+L)、CAT1(系统y+)、CAT4(系统y+)mRNA表达的差异性,以快大型黄羽肉鸡为动物模型,采集30日龄接近平均体重黄羽肉鸡的十二指肠、空肠、回肠和结直肠样品,采用相对定量RT-PCR方法研究不同肠段rBAT、y+LAT2、CAT1、CAT4mRNA表达丰度。结果显示:结直肠rBAT、y+LAT2的mRNA表达丰度极显著低于十二指肠、空肠和回肠(P<0.01),其在回肠表达丰度高于空肠、十二指肠,差异不显著(P>0.05)。结直肠CAT1 mRNA表达丰度极显著高于十二指肠、空肠和回肠(P<0.01),回肠极显著高于空肠(P<0.01),高出十二指肠27.9%(P=0.111)。结直肠CAT4 mRNA的表达丰度极显著高于其他各个肠段(P<0.01),十二指肠、空肠、回肠CAT4 mRNA的表达丰度依次降低,但相互之间无显著差异。结果表明,位于肠上皮黏膜细胞顶端的碱性氨基酸转运系统b0,+和基底部位的系统y+L转运载体mRNA的表达在肠道中的分布类似,显著区别于系统y+。

猪肠道碱性氨基酸转运载体(CAT1)mRNA表达的组织特异性和发育性变化

本研究旨在探讨不同品种猪肠道碱性氨基酸转运载体（CAT1）mRNA表达的组织特异性和发育规律。试验选取1、7、26、30、60、90和150日龄长白和蓝塘公猪各5头（同一品种同一日龄且体重接近），共70头，测体重后屠宰，采集十二指肠、空肠、回肠和结肠组织样品。以18S基因为内标，用实时荧光定量RT-PCR法（SYBR Green Ⅰ试剂盒）检测CAT mRNA在60日龄长白猪十二指肠、空肠、回肠和结肠表达的组织特异性，以及在长白和蓝塘猪不同日龄其十二指肠、空肠、回肠表达的发育性变化。结果显示：60日龄长白猪CAT1 mRNA的表达丰度从十二指肠到回肠呈逐渐升高的趋势，到结肠开始下降，回肠极显著高于其他3个肠段（P〈0．01），十二指肠最低；十二指肠和空肠CAT mRNA的表达在1～26d（即哺乳期）都呈上升的趋势，随后都开始有所下降；蓝塘猪十二指肠CAT1 mRNA的表达丰度在150d时显著低于其他各个阶段（P〈0．05），而长白猪90和150d都显著低于其他各阶段（P〈0．05）；空肠CAT1 mRNA的表达在26～150d各阶段都差异不显著，而26d显著高于1和7d（P〈0．05）；1～60d长白和蓝塘猪回肠CAT1 mRNA的表达都呈逐渐上升的趋势，60d后都显著下降（P〈0．05）。两品种猪不同日龄时十二指肠和空肠CAT1 mRNA的表达量都没有显著差异（P〉0．05）；长白猪回肠CAT mRNA表达在26d时显著高于蓝塘猪（P〈0．05）；在90和150d时，长白猪都显著低于蓝塘猪（P〈0．05），其他各阶段没有显著差异。结果说明，CAT mRNA在不同肠段及不同发育阶段的表达存在明显的差异，这可能与肠腔中氨基酸的浓度和氨基酸的需要水平及相关激素水平有关。

不同蛋白质水平日粮对肥育猪肠道氨基酸转运载体CAT1mRNA表达量的影响

本试验旨在研究不同蛋白质水平日粮对肥育猪肠道氨基酸转运载体CAT1 mRNA表达量的影响。选取36头杜×长×大三元杂交阉公猪,平均体重(55.6±7.0)kg,随机分为3个处理,分别饲喂13%(低蛋白质组)、16%(对照组)和19%(高蛋白质组)的蛋白质水平日粮,每个处理12个重复(单栏饲养)。于饲喂后第45天,每组随机屠宰5头,分离肠道(十二指肠、空肠和回肠),运用Real-Time PCR技术,以β-actin为内参基因,研究CAT1 mRNA相对于β-actin的表达量。结果表明,在饲喂高蛋白质日粮时,与对照组相比,氨基酸转运载体CAT1 mRNA相对于内参β-actin mRNA的表达量,在肥育猪十二指肠、空肠和回肠中分别提高了58.4%、23.2%和24.5%,但差异不显著(P>0.05);而饲喂低蛋白质日粮时,CAT1 mRNA相对表达量在肥育猪十二指肠和空肠中则分别提高93.1%和122.6%,差异显著(P<0.05),而在回肠中降低了14.3%,差异不显著(P>0.05)。高蛋白质水平日粮对肥育猪肠道CAT1 mRNA相对表达量的影响不大,而低蛋白质水平日粮对肥育猪肠道CAT1 mRNA相对表达量的影响较大,尤其是对空肠CAT1 mRNA的相对表达量。

木聚糖酶对肉鸡肠道碱性氨基酸转运载体mRNA表达的影响

480只健康的1日龄父母代黄羽肉鸡随机分为A、B 2组,每组6个重复,每个重复40只鸡。A组饲喂小麦基础日粮,B组饲喂小麦基础日粮添加木聚糖酶(木聚糖酶在日粮中的含量为1.2×104U/kg)。16日龄时,各组每个重复选取2只接近平均体重的试验鸡,采集十二指肠和空肠黏膜样品,用RT-PCR的方法研究添加木聚糖酶对碱性氨基酸转运载体mRNA表达丰度的影响。结果表明,小麦基础日粮添加木聚糖酶显著增加了肉鸡空肠rBAT和CAT4 mRNA的表达丰度(P<0.05),空肠y+LAT2和CAT1 mRNA的表达丰度也有增加的趋势(P>0.05);而对回肠rBAT mRNA的表达丰度没有显著影响,回肠y+LAT2、CAT1和CAT4 mRNA的表达丰度也有增加的趋势(P>0.05)。

肠道氨基酸及氨基酸转运载体研究进展

氨基酸是肠黏膜代谢的能量来源和机体营养物质。氨基酸转运载体是将氨基酸跨膜运输的膜蛋白质。近年来的研究发现氨基酸及其转运蛋白通过调节基因表达和信号转导通路有效地调节细胞内的生理活动,而且氨基酸还是肠道炎症的新型治疗靶点等。本文将围绕近年来氨基酸代谢、氨基酸和氨基酸转运载体在信号转导中的作用、氨基酸抗炎作用及氨基酸转运载体在肠道表达等方面的研究进展进行综述。

不同浓度赖氨酸对猪肠黏膜上皮细胞碱性氨基酸转运载体mRNA表达的影响

研究通过建立猪肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC)原代培养的方法,研究了赖氨酸对体外培养的猪小肠黏膜上皮细胞碱性氨基酸转运载体mRNA表达的影响。用机械刮取初生仔猪小肠黏膜加胶原酶Ⅱ消化的方法,成功地在体外培养了新生仔猪IEC;分别用浓度为0、2、8mmol/L赖氨酸处理细胞96h,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR方法,检测了碱性氨基酸转运载体在不同处理细胞中的表达丰度。结果表明:高浓度的赖氨酸对CAT-1 mRNA的表达有上调作用,差异极显著(P<0.01),并且呈剂量依赖效应;不同浓度的赖氨酸对CAT-2 mRNA的表达影响不大,8mmol/L和2mmol/L赖氨酸组CAT-2 mRNA的表达丰度均有低于0mmol/L的趋势,但二者之间差异不显著(P>0.05);不同浓度的赖氨酸对y+LAT1 mRNA表达影响差异不显著(P>0.05);高浓度的赖氨酸可提高4F2hc mRNA的表达;0mmol/L和2mmol/L赖氨酸组4F2hc mRNA的表达丰度均低于8mmol/L,且差异显著(P<0.05);0mmol/L和2mmol/L赖氨酸组之间差异不显著(P>0.05)。

热应激对蛋鸡肠道菌群结构、碱性磷酸酶活性及氨基酸转运载体mRNA表达丰度的影响

【目的】揭示热应激环境下蛋鸡肠道菌群结构、肠黏膜碱性磷酸酶活性和氨基酸转运载体mRNA表达量的变化机理。【方法】试验选择16周龄济宁百日鸡96只,随机分成对照组((24±1)℃;Ⅰ)和热应激((38±1)℃)组,各组设6个重复,每个重复8只,试验持续14 d。采用16S rDNA的PCR-DGGE技术和实时荧光定量PCR等手段,分析热应激2(Ⅱ)、7(Ⅲ)、14 d(Ⅳ)时,对十二指肠、空肠及回肠内容物菌群多样性和肠黏膜碱性磷酸酶活性以及氨基酸转运载体rBAT、y+LAT1、CATl mRNA基因表达的相对丰度变化规律。【结果】热应激7 d开始各肠段菌群多样性较为丰富,热应激7、14 d时空肠和回肠部位敏感乳杆菌(Lactobacillus agilis),回肠部位约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、不可培养细菌(uncultured bacterium)和不可培养的拟杆菌属(uncultured Bacteroidales bacterium)均末检测到;而热应激不同时间段空肠和回肠部位可检测到不可培养细菌、溃疡拟杆菌(Bacteroides helcogenes)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei);空肠和回肠部位黏膜上皮细胞表面的碱性磷酸酶活性与Ⅰ组比较显著下降(P<0.05);而空肠和回肠Ⅲ组的rBAT、y+LAT1mRNA表达丰度均最低,空肠在各热应激时段表达丰度变化幅度最大(P<0.05),回肠的CAT1mRNA表达丰度在Ⅲ、Ⅳ组与Ⅰ组比较影响更明显(P<0.01)。【结论】热应激对空肠和回肠部位微生物菌群影响较为明显,肠道微生物群落改变可导致肠道的消化吸收功能发生改变。

氨基酸转运载体LAT1研究进展

哺乳动物氨基酸的跨膜运输由多种氨基酸转运载体蛋白介导,其中L型氨基酸转运载体1(LAT1)属于L系统,主要转运大分子支链氨基酸和芳香族中性氨基酸。研究表明,LAT1广泛存在于哺乳动物肝脏、骨髓、大脑、胎盘、心脏和睾丸组织中,LAT1在恶性肿瘤中大量表达,对其不断的增殖起着重要的作用。目前国内对氨基酸转运载体LAT1的研究仍是空白,鉴于LAT1的研究在医学、营养等生命科学领域的研究意义,本文就氨基酸转运载体蛋白LAT1的表达、调节及其相关研究进展作一综述。

氨基酸转运载体研究进展

氨基酸转运载体是介导氨基酸跨膜转运的膜蛋白,在氨基酸营养机体细胞和神经调节过程中起着重要作用;而且,其功能异常会导致严重的氨基酸吸收和代谢障碍性疾病,也具有重要的病理学意义。本文就近年来关于中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸转运载体家族成员及其组织分布、分子生物学特征、生理功能和病理学意义等研究进展进行了综述。

兴奋性氨基酸载体1和谷氨酸胱氨酸转运体在锰干扰谷胱甘肽合成中的作用

目的探讨兴奋性氨基酸载体1(EAAC1)和谷氨酸胱氨酸转运体(Xc-)在锰干扰谷胱甘肽(GSH)合成过程中的作用,为阐明锰中毒的发病机制和预防提供依据。方法清洁级昆明小鼠56只,雌雄各半,按体重随机分成4组(对照组及低、中、高剂量染锰组),每组14只。对照组腹腔注射0.9%氯化钠,低、中、高剂量染锰组的MnCl2染毒剂量分别为12.5、25、50 mg/kg,注射剂量均为5 ml/kg。每天染毒1次,持续2周。观察小鼠的一般形态及体重变化,HE染色观察脑纹状体的组织形态改变,FJC荧光染色观察纹状体内神经元退行性病变,试剂盒检测GSH含量,免疫组化法检测EAAC1和xCT的阳性表达,Western blotting法检测纹状体内EAAC1和xCT蛋白水平的变化。结果随着染锰剂量的增加,与对照组相比,小鼠精神状态先兴奋后逐渐倦怠,皮毛光泽逐渐减退且不整齐;同一时间的各组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。25、50 mg/kg MnCl2组小鼠脑纹状体的组织形态损伤逐渐加重,神经元退行性病变进行性加重,细胞数目逐渐减少。与对照组相比,25、50 mg/kg MnCl2组小鼠脑纹状体内GSH含量降低,EAAC1和xCT的阳性表达和蛋白水平均下降,且50 mg/kg MnCl2组下降最明显,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论过量的锰暴露可致小鼠脑纹状体内GSH合成障碍,其机制可能与EAAC1和xCT的调控障碍有关,从而对机体造成氧化损伤。

碱性氨基酸转运载体的研究进展

碱性氨基酸转运载体广泛分布于动物机体中,并对动物机体内氨基酸的转运和调节起着重要作用,其变异会导致胱氨酸尿症、赖氨酸尿性蛋白不耐症等疾病,引起氨基酸吸收代谢紊乱。综述了碱性氨基酸转运载体的结构、表达、功能及其调节的研究进展。

猪氨基酸转运载体b^(0,＋)AT-2的分子克隆及其序列分析

本研究克隆了b0,+AT-2的全长cDNA序列。基于NCBI发布的人和鼠b0,+AT序列,应用生物学软件进行序列比对后在同源区设计引物,获取cDNA片段;再利用RACE技术克隆了其全长cDNA序列。生物信息学分析显示:猪b0,+AT-2的全长1 488 bp,包括90 bp的3′非翻译区(UTR)和126 bp的5′UTR;编码区(CDS)编码423个氨基酸残基,分别和人、鼠b0,+AT以及猪b0,+AT-1有75.1%、71.9%和86.6%的同源性。

小鼠乳腺泌乳过程中氨基酸转运载体Slc7a1、Slc7a5基因mRNA表达分析

通过试验饲养泌乳小鼠,每天测量母鼠的体质量和采食量,在不同泌乳阶段采集乳腺组织,提取RNA,反转录成cDNA,荧光定量PCR分析氨基酸转运载体Slc7a1、Slc7a5基因mRNA的表达差异。结果表明,随着泌乳的开始,母鼠的采食量逐渐增加;Slc7a1基因mRNA的表达量在泌乳中期达到最高,为妊娠期的1.94倍(P<0.05),而在其他时期差异不显著;Slc7a5基因mRNA的表达量在整个泌乳阶段都显著增加,与妊娠期相比,在泌乳12 d时的表达量达到最高,为妊娠期的15.93倍(P<0.01)。说明Slc7a5载体可能在乳腺氨基酸转运中的作用更重要。

必需氨基酸上调乳腺腺泡中L型氨基酸转运载体1的表达

为探讨泌乳乳腺中必需氨基酸与L型氨基酸转运载体1(L-type amino acid transporter 1,LAT1)表达之间的关系,本研究通过体外构建奶牛乳腺泌乳模型,采用免疫印迹方法检测生理浓度的必需氨基酸对乳腺腺泡中LAT1及其辅因子4F2重链(4F2heavy chain,4F2hc)表达变化的影响。结果表明,生理浓度的必需氨基酸显著上调体外培养的奶牛乳腺腺泡中LAT1和4F2hc的表达,提示LAT1是奶牛乳腺上皮细胞内负责转运必需氨基酸的主要转运载体,LAT1和4F2hc的表达受必需氨基酸的诱导。

兔抗鸡碱性氨基酸转运载体b^(0,+)AT多克隆抗体的制备及其效价和特异性分析

为了获得兔抗鸡碱性氨基酸转运载体b0,+AT多克隆抗体,并对多克隆抗体进行特异性分析,本试验利用鸡b0,+AT cDNA全序列(GenBank登录号HQ338713)进行生物信息学分析,预测其蛋白质理化性质、跨膜区域、二级结构及抗原表位,并设计出1段抗原多肽;构建鸡pET-32a(+)-b0,+AT质粒,原核表达融合蛋白经纯化后,注射于新西兰大白兔,经3次加强免疫后,制备兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体,并采用酶联免疫分析(ELISA)和蛋白质免疫印迹(Westernblot)技术分析其效价和特异性。结果如下:1)鸡肠道b0,+AT分子质量为53.8 ku,等电点为8.27,编码493个氨基酸,其中含33个强碱性氨基酸残基(K、R)、28个强酸性氨基酸残基(D、E)、235个疏水性氨基酸残基(A、I、L、F、W、V)、122个极性氨基酸残基(N、C、Q、S、T、Y);经推测,b0,+AT有12个跨膜螺旋结构,由32.05%α-螺旋、25.96%延伸链和41.99%无规则卷曲组成。2)成功构建了鸡pET-32a(+)-b0,+AT质粒并获得兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体,抗体效价可达到1∶204 800,且特异性较好。3)利用制备的兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体作为一抗,肠道组织膜蛋白为抗原,采用Western blot验证获得预期的特异性条带,一抗稀释比例为1∶4 000。结果提示,本试验成功制备了与膜蛋白b0,+AT特异性较好的多克隆抗体,同时其在鸡肠道组织中具有较好的应用效果。