N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的快速纯化及性质

通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析及阴离子交换层析等三步 ,有效地从一菌株NO .2 2 6 2中纯化了N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶。结果表明 ,酶活性回收约 2 0 %,纯化了 8 4倍。天然PAGE与SDS PAGE分析表明 ,该酶分子为同源四聚体 ,单体分子量约为 3 5kD。酶催化反应的最适pH为 7 7～ 8 0 ,最适温度为 45℃。以N 氨甲酰 DL 丙氨酸为底物时 ,Km =1 3×1 0 - 3 mol L ,Vmax=0 .3 3mol min。二价金属离子Ni2 + 有激活作用 ,Zn2 + 有明显的抑制作用 ,而Co2 + 对酶活无影响。该酶N 末端 8个氨基酸残基依次为TRQKILAF。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶基因的克隆与表达

按本室纯化的N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶 (DCase)的N 末端氨基酸序列设计了正向引物 ,并在已报道的不同来源菌株DCase的氨基酸序列同源性分析的基础上 ,设计了反向引物。用菌株No . 2 2 62总DNA为模板 ,经PCR扩增获得长度为约0 9kpb的片段 ,DNA序列分析表明基因全长为 912bp。将该片段插入 pET 3a ,构建成重组子 pET DCase ,并在E coliDH5α中获得表达 ,经SDS PAGE检测 ,表达产物分子量与天然纯DCase相同 ,约为 35kD。

氨基酸酰胺类化合物的合成

阐述了氨基酸氨基保护的常用方法和试剂,氨基酸酰胺类化合物合成的基本原理和方法以及在合成中需要注意的问题。重点阐述了氨基酸酰胺类化合物的合成机理和合成方法。展望了氨基酸酰胺类衍生物的合成方向。

氨基酸酰胺类化合物的简便合成

报道一种氨基酸酰胺类化合物的简便合成方法。以氨基酸和酰氯为原料,利用酰氯与氨基反应速率比与水反应快的原理,将氨基酸溶于0.2 mol·L-1NaOH溶液中,于0℃直接加入酰氯,高产率(约85%)地合成了三个氨基酸酰胺类化合物,同时保留的羧基功能基可以进一步反应。其结构经1H NMR,13C NMR,MS及元素分析等确证。

N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的融合表达、纯化和酶活性

将菌株SS-ori的N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因(DCase)插入到pMAL-c2X载体中,构建表达产物为麦芽糖结合蛋白(MBP)与DCase融合的重组子。该重组子在E.coliBL21中的表达产物为融合蛋白MBP-DCase(76.4ka),光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的19%。经Amy-lose亲和纯化和Superose12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X的背景,用FactorXa剪切后,可得约41.7ka的MBP和34.7ka的DCase。酶活性检测表明当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸做为底物,A600=10时,每升菌体每小时可产生D-缬氨酸0.78g。

氨基酸酰胺类化合物的简便合成

报道一种氨基酸酰胺类化合物的简便合成方法。以带芴甲氧羰基(Fmoc)保护基团的氨基酸为原料,经过酰氯化后,选择可以溶解酰氯但不溶解酰胺的溶剂溶解,然后直接与简单胺类反应沉淀出产物,得到高产率的氨基酸酰胺类化合物。产物结构经元素分析、1H-NMR、13C-NMR、IR等手段证实。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶生产菌的选育

以产N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的恶臭假单胞菌MZ0315为出发菌株,应用紫外和硫酸二乙酯的复合诱变,经底物类似物5-氟尿嘧啶的筛选,获得高产、稳定的优良菌株MF0506。经过发酵培养基优化,诱变株的产酶活力由出发菌株的0.443u/ml提高至0.680u/ml。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶研究进展

用生物转化法生产D 氨基酸已经成为国内外半合成抗生素行业的支柱之一。此外 ,D 氨基酸及其衍生物还是甜味剂、拟除虫菊脂、多肽激素等诸多产品的重要中间体。介绍D 氨基酸生物转化中N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶的一些生化性质。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的固定化工艺

以TJS环氧基树脂作为载体对N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶进行固定化,最佳工艺条件为:1g树脂载体大约对应133U酶液,蛋白质量浓度0.35mg/mL,固定时间15h,温度28℃,pH7.5,固定化酶活达到58.5U。蛋白固定率可达97.4%,酶活回收率达到49.3%,得到的固定化酶使用半衰期达到26批。

重组大肠杆菌共表达D-海因酶和N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶

通过PCR分别扩增得到N-carbamoylase基因和上游带有RBS区的D-hydantoinase基因,并将其依次克隆入pBAD/HisA质粒中,得到呈多顺反子结构的双酶表达质粒pBAD-CRH,转化E.coliTop10F′得到重组菌TaraCRH.实验证明,E.coliTaraCRH对外源蛋白的表达控制严紧,而加入阿拉伯糖诱导后可以成功表达两酶基因.诱导条件优化结果表明,诱导温度采用29℃,培养基中阿拉伯糖浓度0.05g/L可达到最高酶活.进一步尝试采用玉米浆培养基代替LB培养基,在经过优化的玉米浆培养基中培养TaraCRH菌株,经阿拉伯糖诱导,海因酶和水解酶酶活分别达到3.52和4.21U/mL.

氨基酸酰胺的制备

氨基酸酰胺是一类很重要的中间体和合成试剂。由它可以合成噻唑氨基酸及(口恶)唑啉肽类等具有强抗肿瘤活性的化合物。由氨基酸制备相应酰胺的方法有。(1)先转化为相应的酯,再氨解制得。但对α-位空间位阻大的氨基酸不够理想。(2)先转化为酸酐,如与氯代甲酸异丁酯作用得混合酸酐,氨解,一般说产率较高。

基于氨基酸酰胺骨架的双功能胍催化β-酮酸酯与硝基烯的不对称Michael反应:一种合成双环β-氨基酸的简便方法

胍基团具有高的pKa值及双氢键绑定识别受体等特性，胍类化合物在化学和生物学等领域表现出重要作用．近几年，新颖、简便、高效的手性胍催化剂的合成和应用受到越来越多的关注．

假单胞菌菌株ON-4a中的一个新型N—氨基甲酰—L—氨基酸酰胺水解酶：在大肠杆菌中表达的N—氨基甲酰—L—半胱氨酸酰胺水解酶的纯化和特性研究 Ohmachi T等[Appl microbiol biotechnol，2004，65（6）：686．693]

从表达编码假单胞菌菌株ON-4a的N-氨基甲酰-L-半胱氨酸(NCC)酰胺水解酶基因的大肠杆菌的粗提物中纯化了NCC酰胺水解酶并进行了特性研究。用三步柱色谱将该酶纯化58倍达到同质，收率为16．1％。在交联葡聚糖S-300上的凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果表明该酶是同一45kD的亚单位的四聚物蛋白。酶活性的最适pH和温度分别为9．0和50℃。

Desmosdumotin-C B环氨基酸酰胺修饰衍生物的合成与抗肿瘤活性评价

目的设计、合成desmosdumotin-C的B环修饰衍生物,并考察其体外抗肿瘤活性。方法以2,4,6-三羟基苯乙酮为起始原料,经苯环烷基化、4-O-烷基化2步反应制得多烷基取代的A环;以对醛基苯甲酸为原料,经Schotten-Baumannn反应制得含有氨基酸酰胺结构的B环;最后通过Claisen-Schmidt反应连接A环和B环或芳醛制得目标化合物。通过磺基罗丹明B法对所合成的目标化合物进行体外肿瘤细胞增殖抑制活性评价。结果制备合成了17个目标化合物,其中12个为新化合物,其结构经MS,1H-NMR确证;目标化合物体外抗肿瘤活性表明,大部分化合物的活性优于或相当于desmosdumotin-C。结论通过对先导物desmosdumotin-C进行结构修饰和改造可有效提高化合物的抗肿瘤活性,如在A环引入长烷基链,在B环引入卤素、氨基酸酰胺结构等,为后续desmosdumotin-C衍生物的结构优化提供方向和数据支持。

手性氨基酸酰胺催化剂的发现及研究进展

自从L-脯胺酰胺被发现能高效催化不对称aldol反应以来,手性氨基酸酰胺催化剂的设计及不对称催化研究一直受到关注。特别是"烯胺-双氢键"模型的提出为设计新型有机小分子催化剂提供了理论依据,使催化剂的结构设计趋于多样化。本文重点总结了含有单氢键给体、双氢键给体及多氢键给体的氨基酸酰胺催化的不对称催化反应,主要包括不对称直接aldol反应、Mannich反应、Michael加成反应、环加成反应、串联环化反应、Biginelli反应等方面的研究进展。

多肽分子中C-末端酰胺化氨基酸残基的鉴定

本文报道了一种新的鉴定多肽分子C-末端酰胺化氨基酸残基的方法,17种酰胺化氨基酸的DABTC衍生物标准品在高效液相色谱上得到充分分离与鉴定,采用上述方法对多肽激素TRH、LHRH、SP及PLG中的C-末端酰胺化氨基酸残基的鉴定同样得到满意结果。

丙氨酰谷氨酰胺氨基酸(18)注射液对术后食管癌患者的疗效研究

目的探讨丙氨酰谷氨酰胺氨基酸(18)注射液对术后食管癌患者预后的影响。方法选取我院2016年9月至2018年12月收治的46例食管癌患者,随机将其分为观察组[常规治疗+丙氨酰谷氨酰胺氨基酸(18)注射液]与对照组(常规治疗),各23例。对比两组患者治疗前后Gal-3、D-二聚体、COX-2水平及治疗总有效率。结果治疗前,两组的Gal-3、D-二聚体、COX-2水平比较无统计学差异(P>0.05);治疗后,观察组的Gal-3、D-二聚体、COX-2水平均低于对照组(P<0.05)。观察组的治疗总有效率显著高于对照组(P<0.05)。结论丙氨酰谷氨酰胺氨基酸(18)注射液能够有效改善患者的营养状况,提升治疗效果。