构建氯化血红素/G-四链体DNA酶比色生物传感器检测食品中苏丹红

以苏丹红Ⅲ核酸适配体为识别元件,以氯化血红素/G-四链体DNA酶为信号探针,结合杂交链反应信号放大策略,构建一种简单、新颖、高灵敏的生物传感器,用于苏丹红比色检测。在优化条件下,对该方法的灵敏度、准确性、特异性进行评估,最后将其应用食品中苏丹红Ⅲ快速检测,并与GB/T 19681-2005法对比验证。结果显示,在优化条件下,苏丹红Ⅲ质量浓度在0.5~250 ng/mL范围与450 nm波长处的吸光度呈良好线性关系(相关系数为0.995),方法检测限为0.09 ng/mL。特异性分析显示,本方法可用于苏丹红I~IV的检测。实际样品分析中表明,食品中苏丹红Ⅲ加标回收率为84.3%~101.6%,相对标准偏差为4.13%~8.36%,本方法的加标回收率与GB 19681-2005法相比差异不显著(P>0.05)。该方法操作简便、准确可靠、灵敏度高,适用于批量食品中苏丹红的快速检测。

基于分子间裂分G-四链体-氯化血红素DNA酶自组装纳米线的“Turn-on”型汞离子传感研究

以聚苯乙烯微球为载体,利用杂交链式反应,发展了一种基于T-Hg^(2+)-T特异性识别及串联分子间裂分G-四链体-血红素DNA酶纳米线催化信号放大的Hg^(2+)"Turn on"型高灵敏生物传感器。当汞离子存在时,"T-Hg^(2+)-T"特殊结构的形成促使微球表面修饰的富T探针打开并捕获设计的发夹探针P1,由此引发与发夹探针P2之间的杂交链式反应。由于P1、P2的5'游离末端及3'游离末端都包含富G序列,通过杂交链式反应相互拉近并串联排列,在微球表面折叠形成包含串联分子间裂分G-四链体-血红素DNA酶的自组装DNA纳米线。在最优实验条件下,传感器对Hg^(2+)的线性检测范围为2 pmol/L～1 nmol/L,检出限为1.5 pmol/L;当试样中的共存离子大量存在时,传感器对Hg^(2+)仍然具有高的选择性。此方法检测Hg^(2+)具有良好的选择性、灵敏度及稳定性。

基于G-四链体-氯化血红素DNA酶比色法测定银离子和汞离子传感器的构筑

利用G-四链体DNA(5′-CTGGGAGGGAGGGAGGGA-3′)与氯化血红素结合形成G-四链体-HeminDNA酶,其能高效催化H2O2氧化反应底物由无色变为绿色,当溶液中有Ag^+或Hg^2+存在时会阻碍该DNA酶的形成,导致绿色溶液变浅。基于此,建立了比色法测定Ag^+和Hg^2+的传感器。在最佳实验条件下,溶液的吸光度与Ag^+和Hg^2+浓度分别在100.0~1000.0nmol/L和80.0~800.0nmol/L范围内具有良好的线性关系,检出限(3δ/Slope)分别为55.9nmol/L和64.3nmol/L。该方法具有较好的选择性,采用该方法对实际样品进行测试,结果满意。

基于滚环扩增及串联G-四链体-血红素DNA酶的高灵敏“Turn-on”型Hg^(2+)传感器研究

以聚苯乙烯微球为载体,利用滚环放大技术,发展了一种以串联G-四链体-血红素DNA酶催化及T-Hg^(2+)-T特异识别为基础的"Turn-on"型Hg^(2+)高灵敏生物传感器,用于尿液样本中Hg^(2+)的高效检测。通过链霉亲和素和生物素的特异性结合,将富T生物素化Hg^(2+)捕获探针固定至微球表面,当Hg^(2+)存在时,通过形成T-Hg^(2+)-T结构将含有G-四链体互补序列的环化单链DNA序列捕获至微球表面,滚环扩增后在微球表面产生大量包含串联G-四链体的DNA序列。当氯化血红素(Hemin)插入G-四链体后,形成具有增强催化活性的G-四链体-hemin DNA酶,可催化ABTS和H_2O_2反应形成ABTS^(·+),在420 nm处具有最大吸收。考察了多种因素对检测体系的影响,在最优实验条件下,此方法对Hg^(2+)的线性检测范围为0.4~100 pmol/L,检出限为0.3pmol/L(S/N=3),回归方程为△A_(420 nm)=0.1+0.0019C_(Hg^(2+))(pmol/L)。当共存离子大量存在时,传感器对Hg^(2+)仍然具有高的选择性。应用于尿液样品中Hg^(2+)检测,加标回收率为94.0%~106.0%,相对标准偏差(RSD)为1.4%~2.6%。此方法具有良好的选择性、灵敏度及抗干扰能力,可用于复杂样品中Hg^(2+)的检测。

基于G-四链体-氯血红素DNA酶的传感器对血清中甲胎蛋白的检测

建立了一种夹心式用于检测血清中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的新型传感器。利用微孔板表面羧基与抗体表面的氨基之间的相互作用,将AFP的单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAbs)修饰到微孔板的表面;再利用抗体抗原的定向固定效应,将AFP键合到McAbs的表面,接着将生物素标记的AFP单克隆抗体(biotinylated McAbs)与AFP结合;最后,利用链霉亲和素(streptavidin,SA)与生物素的特异性结合作用,将G-四链体-氯血红素DNA酶键合到生物素标记的单克隆抗体上,从而制得高灵度、高特异性的AFP传感器。用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)-H2O2体系检测AFP的浓度,信号值与AFP的浓度在0.05 ng·mL-1至20 ng·mL-1之间成线性关系,检测限为0.02 ng·mL-1。此传感器可应用于血清中AFP的检测。

血红素/G-四链体DNA酶的活性增强研究及其在生物传感器中的应用进展

血红素/G-四链体DNA酶是一类具有类过氧化物酶活性的DNA分子,因其具有出色的活性、易修饰性和可编程性,被广泛应用于生物传感器等领域。本文先是简要介绍了G-四链体的结构,再主要综述了增强血红素/G-四链体DNA酶活性的策略及基于血红素/G-四链体DNA酶的生物传感器在生物标志物、微生物与生物毒素以及金属离子检测中的应用,并展望了血红素/G-四链体DNA酶的未来发展趋势。

基于氯化血红素对G-四链体/盐酸小檗碱复合物的竞争作用构建DNA逻辑门

利用荧光法研究了盐酸小檗碱对不同DNA构象的识别能力,研究发现盐酸小檗碱与G-四链体有较强的相互作用,形成的复合物可以在530nm处发出较强的荧光.当一定量的氯化血红素加入到G-四链体/盐酸小檗碱复合物中时,氯化血红素与G-四链体结合力更强,从而把盐酸小檗碱置换出来,荧光发生猝灭.利用这种荧光信号的开关响应,成功构建了INHIBIT逻辑门.

基于改进G-四链体DNA酶的电化学适配体传感器构建及卡那霉素高灵敏检测

将阳离子多肽(peptide)与G-四链体DNA酶(G4 DNAzyme)共价组装得到高活性的G4 DNAzyme-peptide复合物,进一步构建新型电化学适配体传感器,研究该复合物对电化学适配体传感器响应性能的影响,并将该传感器用于牛奶中卡那霉素(KANA)的检测分析。结果表明:G4 DNAzyme-peptide可以显著放大电化学信号,明显提高传感器检测灵敏度;在捕获探针序列最优浓度(2.0μmol/L)下,电流信号强度变化与目标物浓度(0.06 pmol/L~20 nmol/L)对数值呈良好的线性关系,检测限为0.02 pmol/L,优于其他KANA检测方法;该传感器对KANA具有良好的选择性,在实际牛奶样品检测中,KANA的加标回收率为97.1%~105.5%,相对标准差为3.60%~5.74%,且检测结果与ELISA法一致,说明该传感器能够实现牛奶中KANA的高灵敏检测。

聚多巴胺包埋G-四联体/血红素DNA酶制备过氧化氢生物传感器

利用多巴胺的氧化自聚实现对G-四联体/血红素DNA酶的包埋,成功构建了H2O2电化学生物传感器。DNA和血红素混合得到G-四联体/血红素复合物;DNA酶物理吸附在玻碳电极上后,将10μL 5 g/L多巴胺的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)滴在表面,空气中的氧气氧化多巴胺形成聚多巴胺膜,实现DNA酶的固定。考察了不同DNA序列对传感器性能的影响,表明电化学与光学传感过程具有不同序列响应。此传感器对H2O2的检出限为2.2μmol/L;线性范围为0.01～1.5 mmol/L。本研究证实了利用聚多巴胺固定酶和用DNA酶代替天然酶构筑传感器的可行性。

基于氯化血红素/G-四链体比色分析检测食品中赭曲霉毒素A

为了满足食品质量安全并快速检测食品中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)的含量,探究基于氯化血红素/G-四链体比色分析检测OTA的方法。通过引入两条无标记DNA单链,其中链1由OTA适配体和富含鸟嘌呤的序列组成,链2与链1部分互补。无OTA时,两条DNA链杂交成双链,氯化血红素因聚集使其酶活性降低。而有OTA时,OTA与链1中适配体特异性结合,双链解离,链1中富含鸟嘌呤的序列与氯化血红素结合形成具有酶催化活性的G-四链体结构,可催化过氧化氢氧化2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)使溶液呈深绿色,最大吸收波长420 nm。OTA检测的线性范围为0.001~2.5μmol/L(R2>0.99),检出限为70.3 pmol/L(3α/κ,n=10)。将此方法用于食品中OTA的检测,加标回收率为91.9%~109.0%,表明该探针能够准确、灵敏地检测食品中的OTA。

基于G-四链体-血红素和链式放大反应的基因检测传感器的构建

该文以特殊设计的DNA序列为捕获探针,以G-四链体-血红素复合物作为信号分子,利用链式反应实现目标DNA的灵敏检测。在目标DNA存在时,捕获探针与目标DNA相互识别,同时目标DNA能与辅助探针发生连续的链式反应,从而在电极表面引入大量G-四链体结构。血红素存在下,G-四链体可与血红素结合形成具有很强电化学信号的G-四链体-血红素复合物。用差分脉冲伏安法(DPV)扫描得到的电化学信号与体系中的目标DNA浓度存在对应关系,从而实现对目标DNA的检测。在各组分浓度最适的情况下,电流响应值与目标DNA浓度在0.01~10 pmol/L内具有良好的线性关系,检出限可达8 fmol/L。该传感器灵敏度高、特异性好,具有良好的应用前景。

基于磁纳米颗粒和G-四链体DNA酶的Hg^(2+)传感器研究

以磁纳米颗粒(MNPs)为固定DNA探针的固相载体,发展了一种基于分子间裂分G-四链体-血红素DNA酶以及T-Hg^(2+)-T结构的Hg^(2+)"Turn on"检测生物传感器.考察了多种因素对检测体系的影响,在最优实验条件下,该传感器体现出良好的选择性、灵敏度以及抗干扰能力,而且具有可靠的实际水体样品检测能力.以磁纳米颗粒为固相载体,可实现高效、快速及简单的分离,有效的提高检测灵敏度和降低背景信号.

基于发卡探针DNA/G-四链体模拟酶结构转化的高灵敏无标记荧光检测DNA

建立了基于目标DNA诱导的发卡探针DNA转化为G-四链体DNA过氧化物模拟酶的非标记荧光增强型DNA检测新体系。发卡探针DNA即分子信标探针由两部分构成,环状部分与目标DNA互补,茎部一端由一条富G序列构成。无目标DNA存在时,分子信标处于闭合状态,形成发卡结构;富G序列由于部分处于杂交状态,无法形成G四链体。当目标DNA与发卡探针DNA杂交并打开发卡结构,富G序列解链并自发折叠成G-四链体结构。G-四链体结构与血红素结合形成DNA模拟酶,催化H2O2还原的同时将无荧光的底物10-乙酰基-3,7-二羟基吩恶嗪（ADHP）氧化成荧光产物。通过测量荧光信号,实现对目标DNA的定量检测。优化后的体系检测条件为p H 8.0,10 mmol/L K＋,0.2μmol/L Hemin,50μmol/L ADHP。在优化的条件下,目标DNA在0.005~1.0 nmol/L浓度范围内与体系荧光信号呈线性关系,检出限为3.0 pmol/L。本方法可以区分完全互补和单碱基错配的目标DNA。

基于G-四链体发夹引物的DNA聚合酶荧光检测新方法

利用G-四链体与荧光染料N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)结合发出的强荧光做检测信号,提出了一种DNA聚合酶荧光检测新方法。包含富G序列的DNA发夹引物(HP)在DNA聚合酶作用下发生聚合延伸生成双链DNA,无法形成G-四链体。无DNA聚合酶时,HP上自由的富G序列形成G-四链体,然后特异性的结合NMM产生强荧光信号,信号强度与DNA聚合酶的浓度成反比。该方法具有简单、低成本和高信噪比等优点,在DNA聚合酶活性的实时检测和抑制剂筛选中具有一定的应用潜力。

利用对G-四链体环部的构型调节进行传感器的设计

对鸟嘌呤碱基G重复序列之间连接环结构对G-四链体形成的影响进行了研究。发现在连接环较长,DNA链不易形成G-四链体的情况下,可以通过将环序列设计成双链结构的方式促进G-四链体的重新形成。这就为传感器的设计提供了一个新途径,即可以利用目标分子对环部双链的调节作用控制G-四链体DNA酶的活性。为证明这一点,在双链区域引入T-T碱基错配,破坏双链结构使DNA链不能形成G-四链体。Hg2＋对T-T错配的稳定作用可以促进双链结构的形成,DNA链重新折叠成G-四链体,得到的G-四链体与氯化血红素（ Hemin）结合后形成具有过氧化物酶活性的G-四链体DNA酶,据此构建了Hg2＋传感器。利用此传感器可在10～700 nmol/L范围内实现Hg2＋的定量检测,检出限为8.7 nmol/L。在此基础上,利用半胱氨酸可以将Hg2＋从T-Hg2＋-T碱基对上竞争下来的能力,设计了一种半胱氨酸的检测方法。此方法可以在20～600 nmol/L范围内实现半胱氨酸的定量检测,检出限为14 nmol/L。

G-四链体结构及其应用的光谱学研究

G-四链体是指一种由富含G碱基核酸序列通过G平面的π—π堆积形成的一种特殊的核酸二级结构。本文介绍作者课题组利用光谱表征方法(紫外可见光吸收、圆二色、拉曼、核磁共振光谱等)在G-四链体结构研究领域的最新进展。同时,对本组利用这些光谱技术研究G-四链体DNA酶的相关工作也一并介绍。

G-四链体-氯化血红素DNA酶在传感器设计中的应用

G-四链体-氯化血红素(hemin)DNA酶是一种由特定的核酸G-四链体与hemin结合后形成的具有过氧化物酶活性的人工模拟酶。作为一类重要的DNA酶,G-四链体-hemin DNA酶近年来在分析化学领域受到了越来越多的关注。目前这类DNA酶已被用在了多种传感器,包括金属离子传感器、适配体传感器、酶传感器、DNA传感器及药物传感器的设计当中。本文对G-四链体-hemin DNA酶在传感器设计中的应用进行了系统的介绍和评述,并对其未来的发展进行了初步的展望。

基于RGO/Au NPs和G-四链体/Hemin的过氧化氢电化学生物传感器的制备及性能研究

制备了基于RGO/Au NPs和G-四链体/Hemin的过氧化氢电化学生物传感器,并用于过氧化氢的检测.利用循环伏安法、差示脉冲法和计时电流法对传感器的电化学行为进行了研究,探讨了RGO/Au NPs电沉积圈数以及G-四链体/Hemin孵育时间对传感器性能的影响.结果表明,制备的传感器对过氧化氢具有良好的电化学响应,电流响应信号与过氧化氢的浓度在0.5μmol·L-1~0.1mmol·L-1的范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.15μmol·L-1(S/N=3).该传感器稳定性好、抗干扰强,对细胞中过氧化氢释放量的实时监测具有一定的应用价值.

基于λ核酸外切酶辅助放大的化学发光传感器用于DNA的灵敏检测

基于G-四链体/血红素DNA酶的高催化活性以及λ核酸外切酶（λexo）的辅助放大功能,以17个碱基的DNA片段作为模型分析物,构建了一种快速、灵敏、特异性好的新型Luminol-H2O2-G-四链体/血红素DNA酶化学发光传感体系。考察了λexo用量、Luminol浓度、H2O2浓度、溶液p H值对体系化学发光强度的影响。在最佳实验条件下,即：p H=9.0,10 unitsλexo,1.0×10^-3mol/L Luminol,3.0×10^-2mol/L H2O2,测得DNA在2.0×10^-12~8.0×10^-9mol/L的浓度范围内与Luminol的相对化学发光强度之间呈现良好的线性关系,检出限（3σ）为0.7×10^-13mol/L。本方法可以区分不同错配的核酸序列,并可用于复杂生物样品的分析。

基于酶辅助靶标循环的适体传感器灵敏检测中药中黄曲霉毒素B1

该文基于酶辅助靶标循环信号放大策略构建了用于黄曲霉毒素B1(AFB1)高灵敏检测的化学发光适体传感器。以G-四链体/氯化血红素DNA酶为信号分子设计了免标记的适体探针H1-S1和发夹探针H2。适体探针结合目标AFB1,在核酸外切酶I辅助下,触发靶标循环反应产生发夹H1。发夹H1与H2杂交,释放出完整的G-四链体序列,并进一步与氯化血红素结合形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。DNA酶通过催化氧化鲁米诺-H2O2化学发光体系产生化学发光信号,实现AFB1的放大检测。在最优实验条件下,化学发光强度与AFB1质量浓度的对数在0.001~100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(r2)为0.9955,检出限为0.93 pg/mL,回收率为93.7%~107%。该适体传感器操作简单、灵敏度高、特异性好,在黄曲霉毒素污染检测方面具有良好的应用前景。