氯化铯密度梯度离心法提纯枣疯病植原体DNA

本研究利用CTAB法提取感染枣疯病的枣树叶片总DNA,再通过氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心从总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA。利用枣树26S r DNA基因和枣疯病植原体16S r DNA基因的特异引物,分别对富集纯化前后感病枣树叶片总DNA进行PCR扩增。结果表明,模板浓度为1 ng/μL时,富集后的总DNA模板扩增枣树26S r DNA的电泳条带亮度低于富集前,扩增枣疯病植原体16S r DNA电泳条带亮度明显高于富集前。Real-time PCR检测结果表明,模板浓度为1 ng/μL时,纯化后的枣疯病植原体DNA中26S r DNA相对纯化前的量为0.0638,而JWB相对纯化前的量为0.5035,这说明采用氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心法可以有效地从感染枣疯病枣树总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA。

超速离心结合Real-time PCR分离纯化枣疯病植原体DNA

分离纯化枣疯病植原体基因组DNA,有助于进一步开展对此病原全基因组测序的研究,CTAB法提取枣疯病叶片的总DNA后,采用氯化铯双苯酰亚胺密度梯度离心法从枣树总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA,并通过Real-time PCR方法对分离纯化效果进行定量检测。在此基础上,探索了不同CsCl初始密度对DNA分离效果的影响。在20℃,初始密度为1.650 0g/cm3,经206 000×g下离心23h后,感染枣疯病样品(IS)的离心管中出现2条DNA亮带,正常枣树样品(NS)离心管中只有1条。Real-time PCR检测结果表明NS管中的条带为枣树基因组DNA;IS管中与NS管中相同位置的条带为枣树基因组DNA,另1条带为枣疯病植原体基因组DNA。在保留其他试验条件下,不同CsCl初始密度,会影响DNA条带的位置,也会影响枣疯病植原体DNA与枣树DNA的分离效果,在1.562 2g/cm3的初始浓度下分离效果最好。采用超速离心法可以有效地从感染枣疯病的枣树中分离得到纯的枣疯病植原体DNA,同时利用Real-time PCR法可以实现分离效果的评价,利用此方法分离得到的DNA可用于枣疯病植原体的全基因组测序。