黏病毒抗性蛋白A(MxA)通过增强干扰素刺激应答元件(ISRE)活性诱导HepG2细胞干扰素刺激基因表达

目的研究黏病毒抗性蛋白A(MxA)对HepG2细胞Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)途径的影响。方法采用pcDNA3.1-Flag-MxA转染HepG2细胞,免疫荧光细胞化学染色检测MxA蛋白在HepG2细胞的表达和定位,Western blot法检测MxA蛋白表达;采用MxA小干涉RNA(si-MxA)转染HepG2细胞并以α干扰素(IFN-α)处理细胞,实时荧光定量PCR检测HepG2细胞黏液病毒抗性蛋白A(MxA)、蛋白激酶R(PKR)和寡聚腺苷酸合成酶(OAS)的mRNA表达,Western blot法检测MxA、PKR、OAS、细胞信号转导子与转录激活子1(STAT1)、磷酸化的STAT1(p-STAT1)、STAT2、p-STAT2和干扰素调节因子9(IRF9)的蛋白表达。此外,pcDNA3.1-Flag-MxA与pISRE-TA-luc分别共转染至HepG2和HepG2.2.15细胞,荧光素酶活性检测干扰素刺激应答元件(ISRE)活性。结果MxA蛋白在HepG2细胞质和细胞核均有表达且细胞质表达量高于胞核。敲低HepG2细胞中MxA表达虽不影响IFN-α诱导的STAT1、p-STAT1、STAT2、p-STAT2和IRF9蛋白的表达,但显著降低抗病毒蛋白PKR和OAS的表达。过表达MxA的HepG2细胞ISRE活性增强且PKR和OAS蛋白表达增高,但这种效应却在HepG2.2.15细胞中被抑制。结论MxA通过增强JAK/STAT信号通路ISRE活性诱导抗病毒蛋白表达。

抗原处理相关转运蛋白基因多态性与原发性肝细胞癌的相关性研究

目的探讨抗原处理相关转运蛋白（TAP）基因多态性与原发性肝细胞癌发生的相关性。方法采用PCR-扩增抗拒突变系统（PCR-ARMS）技术分析76例原发性肝细胞癌患者及150例健康个体的TAP1、TAP2等位基因多态性。结果肝癌组和健康对照组中共检测出4种TAP1及7种TAP2等位基因。TAP2B在肝癌组的分布频率显著高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05,OR=1.80,95%CI=1.06-3.04）。结论TAP2B可能导致患原发性肝细胞癌的相对危险性增加。

转铁蛋白基因增强水稻对氧化胁迫与稻瘟病菌的抗性

对转豌豆铁蛋白 (pea ferritin,Fer)基因水稻 T1代的 53个株系进行 PCR检测 ,52个株系能扩增出阳性 PCR产物。通过测定光合作用过程中最大光化学通量 (Fv/ Fm 值 )分析了由百草枯处理引起的 T1代水稻叶片的氧化损害。与未转基因水稻相比 ,转Fer基因水稻的叶片对氧化胁迫的耐受能力有不同程度的增强。百草枯处理后转基因植株叶片叶绿素含量与水处理叶片相比没有明显下降 ,而未转基因植株叶片叶绿素含量降低至水处理叶片的 2 0 %左右。选取 9株对氧化胁迫耐受能力较强的水稻进行了 Northernblot分析和子代的稻瘟病抗性测定 ,其中 5株转基因植株 Ferm RNA积累增强。病原菌接种后 T2 代转基因植株的病斑数量明显少于非转基因植株。表明转

紫花苜蓿Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性

以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料,利用反转录PCR方法分离了NHX1全长cDNA(命名为MsNHX1)。Southern杂交结果表明,在紫花苜蓿中存在一个小的液泡型Na+/H+逆向转运蛋白基因家族。序列分析表明,该基因所编码的蛋白与拟南芥、水稻和棉花中液泡型Na+/H+逆向转运蛋白具有较高的同源性。在洋葱表皮细胞中瞬时表达MsNHX1-GFP融合基因的结果表明,MsNHX1定位在液泡膜上。Northern杂交发现该基因的表达受高浓度NaCl诱导。MsNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性,说明MsNHX1具有转运Na+的功能。在拟南芥中表达MsNHX1能显著提高植株耐受盐胁迫的能力;而且在受到盐胁迫时,转基因植株比野生型的渗透调节能力更强,生物膜受破坏程度降低,光合能力增强。以上研究结果表明MsNHX1是一个液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白,在植物耐受盐胁迫过程中起重要作用。

小麦类甜蛋白基因的转化及转基因植株的抗病性分析

目前已克隆出许多类甜蛋白基因并成功转化马铃薯、水稻和小麦等植物,均可引起植株抗病性的提高。在以往的研究中我们从小麦中克隆了一个类甜蛋白基因(Ta-Tlp),该基因在高抗白粉病的小麦6VS/6AL易位系中能够高水平表达,推测它与白粉病抗性密切相关。为进一步研究该基因的功能,本研究构建了包含在ubi强启动子控制下的Ta-Tlp基因的表达载体pAHC-TlP,用基因枪将其导入小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织,在含除草剂的选择培养基上经两轮筛选和分化,获得再生抗性植株。对T0、T1和T2代植株进行PCR、Southern杂交与RT-PCR分析,结果表明Ta-Tlp基因已整合进受体基因组并且能够表达。对T0代及其衍生的T1代(来自6个T0代阳性株系的183个单株)和T2代(来自6个T0代阳性株系的241个单株)转化植株进行白粉病抗性鉴定,Ta-Tlp基因超量表达的转基因植株,能延缓白粉病发病进程,其白粉病抗性有一定提高。对T2代阳性转化植株进行赤霉病抗性鉴定表明,其抗性与受体对照相比无显著差异。

转WMV-2外壳蛋白基因西瓜植株的病毒抗性

西瓜是夏季的重要水果 ,病毒病是影响其品质和产量的重要原因之一。植物基因工程的发展为抗病育种提供了新途径。利用外壳蛋白 (coatprotein)基因转化高等植物 ,赋予转基因植物以相应抗病性的成功例子已很多。本文报道WMV - 2CP基因在转基因西瓜植株中的遗传、分离、表达以及转基因植株对病毒病的抗性实验结果。通过自交结合PCR检测 ,发现WMV - 2CP基因在自交子一代的分离符合孟德尔 3∶1的分离比。经过连续 4代的选择鉴定 ,已从T7、T11和T32 3个独立转化子的后代中筛选获得 8个转基因纯合株系 ,性状表现整齐一致。Westernblot结果表明 ,R4 T7-1、R4 T11-3以及R4 T32 -73个不同来源的株系均能表达产生外壳蛋白。转基因纯合株系WMV - 2感染后的病毒抗性实验表明 ,与未转基因对照相比 ,转基因株系可以推迟发病时间 ,减轻发病程度。实验筛选获得的转基因株系R4 T32 -7表现出对WMV - 2的高度抗性 。

转Bt基因棉杀虫蛋白含量时空分布及对棉铃虫产生抗性的影响

采用ＥＬＩＳＡ法（酶链免疫法）、室内初孵棉铃虫生测法和田间棉铃虫为害调查方法，研究和分析了中国构建的 Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）基因抗虫棉品系ＧＫ３和美国构建的Ｂｔ基因棉品系新棉３３Ｂ的不同生育期以及花铃期不同器官的杀虫蛋白含量、校正死亡率和田间受害率变化趋势以及它们之间的关系。结果表明，转Ｂｔ基因棉Ｂｔ杀虫蛋白含量在棉花生育过程中呈时空动态变化，在时间分布上，各生育期顶尖平展叶表现为：初花期＞蕾期、花铃期＞苗期＞吐絮期；在花铃期，各器官表现为：功能叶、茎尖＞小蕾、幼铃＞花蕊、花瓣、苞叶、老叶。室内生测幼虫校正死亡率与棉株Ｂｔ杀虫蛋白含量高度一致；田间表现与Ｂｔ杀虫蛋白含量有一定的差异，除主要受Ｂｔ杀虫蛋白影响外，棉铃虫取食选择性，以及残存高龄幼虫为害和棉株各部位营养结构等也影响其抗虫性，造成后期棉铃虫主要为害花、蕾和幼铃，两材料抗虫性表现较为一致。

转天麻抗真菌蛋白基因提高棉花对黄萎病抗性

黄萎病是全球植棉业的主要病害,严重缺乏抗黄萎病资源导致棉花抗黄萎病育种至今未取得显著进展。采用农杆菌介导法,以下胚轴为受体,将天麻抗真菌蛋白基因转化陆地棉品系苏研060,通过愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化和植株再生,获得大量再生苗。分别以NPT II基因、gafp基因、35S启动子-gafp基因特异引物对再生苗进行PCR检测,将95个阳性再生苗嫁接到海7124幼苗砧木上,获得37个成活植株。RT-PCR检测发现,31个植株出现预期的540 bp扩增片段。盆栽花铃期花粉育性鉴定表明,9个转基因植株雄性败育,22个植株花粉育性正常,通过人工自交得到T1代种子。通过转基因作物隔离区种植、特异引物PCR检测、卡那霉素抗性筛选、自交纯合与选择,培育获得22个T3代转基因纯系。Southern blotting检测发现,转基因植株体内有2个gafp基因拷贝。GAFP蛋白免疫印迹表明,16个转基因纯系出现分子量为14 k D的GAFP蛋白,另6个纯系表现出转录后水平上的基因沉默。黄萎病抗性鉴定结果证实,获得3个抗落叶型黄萎病的棉花株系TG09、TG16和TG23。

氯喹抗性相关基因pfmdrl两个突变点的初步研究

目的 对氯喹抗性相关基因 pfmdrl两突变点进行研究。方法 用新颖的等位基因特异PCR和限制性酶切分析技术 (AS -PCR/RFLP)检测云南恶性疟的与氯喹抗性相关的pfmdrl基因Asn86 Tyr和Asp12 46 Tyr的突变点 ,了解其与氯喹抗性表现型的相关性。结果 在 10个氯喹抗性分离株未检测 pfmdrl基因 86位氨基酸编码子的突变 (Asn86型 ) ;而在 9个氯喹抗性分离株中检测 pfmdrl基因 86位氨基酸编码子由A变为T ,即86 Tyr型。未检测到 pfmdrl基因Asn12 46 Tyr的突变。结论 提示在云南恶性疟氯喹抗性流行区 ,氯喹抗性表现型与pfmdrl基因 86 Tyr的位点突变符合性仅 47 4% ,似无明显关系 ;而基因Asn12 46 Tyr的位点突变似乎是不存在。这支持除Asn86 Tyr突变外 。

转cry1C~*及cry2A~*基因早粳稻Bt蛋白的时空表达和抗螟虫性

早粳稻空育131为受体,以根瘤农杆菌介导遗传转化法创制了转ubi启动子调控下的cry1C*及cry2A*基因早粳稻空育131 (cry1C*)和空育131(cry2A*)。为了研究转基因水稻Bt蛋白的时空表达特性及抗螟虫性,将不同转化事件形成的转基因早粳稻品系种植于田间,利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测转基因水稻不同生长发育阶段不同器官的、以及成熟期糙米的Bt蛋白量,采用室内离体茎秆法接虫鉴定转基因水稻的抗螟虫性。结果显示,转基因早粳稻不同抗虫基因Bt蛋白量不同, cry1C*基因总是低于cry2A*基因的蛋白质表达量;不同生长发育时期Bt蛋白量不同,叶片和茎鞘等器官的Bt蛋白量为分蘖期<抽穗期<灌浆期,幼穗或糙米等器官的Bt蛋白量为抽穗期幼穗>灌浆期幼穗>成熟期糙米;不同器官Bt蛋白量不同,高低次序在分蘖期为叶片、茎鞘,抽穗期为叶片、幼穗和茎鞘,灌浆及成熟期为叶片、茎鞘、幼穗和糙米;同一抗虫基因不同转基因品系间抽穗期叶片、茎鞘和幼穗等器官Bt蛋白量及抗螟虫性、糙米Bt蛋白量等性状存在差异,抽穗期各器官Bt蛋白量与抗螟虫性及成熟期糙米Bt蛋白量之间相关不显著,不论Bt蛋白量高或低的品系均表现为高抗螟虫。转基因早粳稻营养器官生长发育前期Bt蛋白量较低、后期较高,繁殖器官生长发育早期Bt蛋白量较高、晚期较低,营养器官通常比繁殖器官的Bt蛋白量高。在本研究范围内,不同基因及不同转化事件培育的转基因水稻Bt蛋白表达量高低不同,但所有的转基因早粳稻品系均表现高抗螟虫。

草鱼天然抗性相关巨噬蛋白基因全长cDNA的克隆与表达分析

天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)家族是一类抑制胞内寄生菌侵染的天然免疫相关蛋白。本研究克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Nramp基因并进行了表达分析。该基因cDNA序列全长为3 158 bp,编码1个含544个氨基酸的蛋白。该蛋白含有Nramp家族的特征序列:包含12个跨膜区(TM)、1个由20个氨基酸残基组成的胞质内转运结构域(CTM)。草鱼Nramp同其他16个物种的Nramp氨基酸序列同源性在62.5%～90.2%之间。草鱼Nramp基因cDNA的独特结构是其3′末端非翻译区(UTR)和5′UTR各有1个脊椎动物Nramp2中的铁反应控制蛋白结合位点(IRE)。系统进化分析表明,草鱼Nramp和所有鱼类Nramp聚为一簇,与哺乳类Nramp2的亲缘关系较近。Nramp基因在草鱼头肾和脾脏中的表达量最高,在肌肉和皮肤中的表达量最低,在草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染的草鱼肾脏细胞系(CIK)中的表达量明显升高。

由TMV 54×10~3蛋白基因构建的转基因番茄及其对TMV的抗性

通过土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）的介导，将烟草花叶病毒（ＴＭＶ）的５４×１０３蛋白ｃＤＮＡ转入番茄植物中，得到了转基因植株．这些植株抗卡那霉素，具有胭脂碱合成酶的活性．ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明，５４×１０３蛋白基因已整合到番茄基因组上．攻毒实验表明，未转基因的对照组接种病毒２周后即出现花叶，并且随着时间的推移，花叶症状更加典型．而转基因的植物接种病毒后一直到开花结果都未见发病，即没有花叶出现．

牛羊朊蛋白基因(PRNP)多态性与抗病性的研究进展

朊蛋白(PRNP)是近年来造成人和部分哺乳动物传染性海绵状脑病(TSE)的主要根源,该基因的多态性显著影响了人和动物对TSE的易感性或抗病性。本文分析了朊蛋白基因及其编码蛋白的结构与功能;简要介绍了绵羊基因编码区突变与致病性的关系;系统分析了牛科动物启动子区域内23 bp的插入/缺失、第一内含子区域内12 bp的插入/缺失及其与疯牛病(BSE)抗病性的作用机制;全面总结了全球已经报道的牛科动物12和23 bp插入/缺失的等位基因与单倍体频率,评价了其发病的可能性。该研究将为牛的分子育种提供指导。

草苷膦抗性新基因的克隆、序列分析及其蛋白高级结构预测

利用错误倾向PCR(error-prone PCR)突变技术,以可变盐单胞菌(Halomonas variabilis)HTG7的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶基因为模板进行随机PCR扩增,得到目的基因片段(约1·35kb).将该基因片段与pACYC184载体连接后转化EPSP合酶缺陷型菌株大肠杆菌ER2799.利用功能互补筛选法得到了2株不具有草苷膦抗性的EPSP合酶阳性克隆突变株,记为Pmu1和Pmu2.序列分析表明,突变体Pum1的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有2处发生突变,导致氨基酸残基1处发生了改变;突变体Pmu2的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有5处发生突变,导致氨基酸残基2处发生了改变.对突变前后EPSP合酶进行比较预测发现,其三级结构及蛋白中心骨架是大致相同的,但突变前后氨基酸位点肽平面和Cα相连的N键之间形成的扭转角度存在一定的差别.这些结果表明,酶的功能主要由蛋白的构象决定,二肽链形成后肽平面和N键之间角度的变化,造成高级结构构象细微的差别,致使草苷膦抗性功能丢失.

大白菜的马铃薯蛋白酶抑制剂基因转化及抗菜青虫性的鉴定

以大白菜(B.campestrtis ssp.pekinensis)‘北京80号’生长3 d无菌苗的带柄子叶为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法导入马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pin Ⅱ)。通过抗性株的真叶在不定芽诱导培养基上的再生, 证实了嵌合体的存在,并通过此方法来消除嵌合体。获得的转基因植株经PCR、PCR-Southern杂交以及植物基因组Southern杂交证实,目的基因已经整合入植物基因组中。对菜青虫(Pieris rapae L.) 进行了转基因大白菜叶片的连续离体饲喂,结果表明:受试的转基因大白菜对菜青虫的生长发育有较明显的抑制作用。

恶性疟原虫海南分离株pfmdr1基因与氯喹抗性的相关性分析

目的了解海南省恶性疟原虫pfmdr1基因同氯喹抗性的关系。方法采用套式PCR技术特异性扩增pfmdr1基因含有编码第86位、1042位和1246位氨基酸的基因片段,并对扩增产物进行RFLP分析。结果42个样本中,pfmdr1第86位氨基酸均未发生突变,即86位氨基酸是野生型的Asn,而不是突变型的Tyr。第1246位氨基酸发生突变的样本共有7个,全部为抗性虫株。第1042位点PCR扩增结果阳性的37个样本中突变的样本共有10个,其中9个为抗性虫株,一个为敏感虫株。结论我国海南省恶性疟原虫氯喹抗性产生与pfmdr186位氨基酸基因多态性无关,但第1042和1246位氨基酸的突变更易在抗性虫株中检出。

基因工程抗角蛋白抗体在正常皮肤和几种表皮增生性皮肤病皮损中的反应定位

目的 探索一株基因工程人源性抗角蛋白Fab抗体在正常皮肤及几种表皮增生性皮肤病皮损中的反应定位。方法 利用从噬菌体抗体库中筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的质粒转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达出Fab抗体 ,纯化鉴定后用此抗体对正常皮肤及银屑病、鳞癌、基底细胞癌和脂溢性角化病皮损进行免疫组化染色。结果 正常皮肤表皮呈阴性染色 ,毛囊呈阳性染色 ,银屑病、鳞癌、基底细胞癌和脂溢性角化病皮损均呈现明显的阳性着色 ,其中银屑病皮损基底细胞层为强阳性。所有细胞染色部位均位于胞质 ,胞核未见着色 ,真皮为阴性。结论 该株人源性抗角蛋白Fab抗体主要与表皮组织结合 ,对银屑病等表皮增生性皮肤病的损害具有较高特异性。

恶性疟原虫海南分离株pfcrt基因同氯喹抗性的相关性分析

目的探讨恶性疟原虫海南株pfcrt基因多态性同氯喹抗性的关系。方法采集确诊恶性疟患者血样42份,应用套式PCR方法体外扩增pfcrt基因含有编码第76和356位氨基酸的基因片段,并对扩增产物进行限制性酶切分析。结果1)76位点:22个氯喹抗性虫株中有18个发生K76T突变型(81.82%),20个氯喹敏感虫株中野生型和突变型各占50%;2)356位点:所有42个样本的356位点均为野生型。结论我国海南省恶性疟原虫pfcrt基因的K76T突变与氯喹抗性存在一定关联,而356位点可能与氯喹抗性无关。

小鼠金属硫蛋白基因在丝状体蓝藻中的表达及对重金属抗性的提高

应用蓝藻类金属硫蛋白启动子（ｓｍｔＯＰ）的金属诱导性，在丝状体蓝藻鱼腥藻（Ａｎａｂａｅｎａｓｐ．ＰＣＣ７１２０）中表达具有更高金属结合能力和对Ｃｄ２＋有选择特异性的小鼠金属硫蛋白基因（ｍＭＴⅠｃＤＮＡ）。构建穿梭表达载体ｐＫＴＭＲＥ并在大肠杆菌ＨＢ１０１中扩增，经三亲接合转移、链霉素筛选、ＤＮＡ和蛋白质印迹等方法鉴定得到稳定的转基因工程蓝藻。转基因蓝藻对金属离子吸附能力和较高重金属浓度下放氧活性测定表明，外源基因的表达提高了蓝藻对重金属离子的抗性，是野生蓝藻的１．５～２．０倍。

转Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(nhaA)大豆植株的获得及耐盐性分析

高盐对作物造成渗透胁迫和离子毒害,是影响作物生长发育的主要非生物胁迫因子之一。Na+/H+逆向转运蛋白能够通过将Na+排出细胞或将其区隔化入液泡中来调节细胞内的离子平衡,是植物耐盐的关键因子。本研究将质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA构建到植物表达载体pBI121上,通过发根农杆菌介导转化大豆子叶节,获得6株卡那霉素抗性再生植株。对抗性植株进行PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定,3株植株呈阳性,平均转化率为0.42%。对阳性植株的耐盐生理指标测定结果显示,盐胁迫后转基因植株的质膜相对电导率显著低于对照植株,叶绿素含量和脯氨酸含量显著高于对照植株。nhaA基因在大豆植株中的表达显著提高了大豆对盐胁迫的耐受性,为大豆耐盐新品种的选育和广泛应用该基因进行其它农作物的耐盐性改良提供了材料和依据。