恶性疟原虫氯喹抗药性基因pfcrt研究进展

自从1959年第1例抗氯喹的恶性疟病人出现以来[1],恶性疟原虫氯喹抗药性(chloroquine resistance,CQR)已经遍及所有恶性疟流行地区,在东南亚地区CQR引发了更为严重的公共卫生问题,在我国云南、海南等省也有CQR恶性疟的流行.因此,对恶性疟原虫氯喹抗药性的研究已经成为当前疟疾防治研究中的一个重点.随着恶性疟原虫基因组研究的进展,抗药性基因已经成为CQR研究的热点.

用pfcrt点突变基因检测技术检测恶性疟原虫氯喹抗药性的初步研究

目的 建立一种恶性疟原虫氯喹抗药性基因pfcrt点突变的检测方法,以判断是否存在氯喹抗药性。方法 根据恶性疟原虫pfcrt基因序列设计巢式PCR引物,以恶性疟原虫DNA为模板扩增出一条包含第76位密码子的DNA片段;扩增产物经限制性内切酶Apo I消化,用琼脂糖凝胶电泳观察恶性疟原虫pfcrt等位基因是否为突变型。结果 31份样本经巢式PCR扩增均出现14 0 bp左右的特异性片段。酶切消化后,9份滤纸血样本中有4例出现1条14 0 bp左右的片段,为突变型pfcrt等位基因,其余5份出现97bp与4 8bp两种酶切片段,为野生型pfcrt等位基因;2 2份血涂片样本中有10份突变型,突变率为4 5 .16 %。14例突变样本中,有1例体内实验氯喹治疗有效。结论 巢式PCR- RFL P法可以快速、高效的检测恶性疟原虫pfcrt基因76位密码子的点突变,并且能够初步应用于恶性疟原虫氯喹抗药性的鉴别。

云南边境地区氯喹及与青蒿琥酯伍用治疗前后恶性疟原虫pfcrt和pfmdr1抗药性有关基因点突变的变化特征(英文)

目的 了解氯喹单用及与青蒿琥脂伍用治疗恶性疟前后 ,pfcrt和 pfmdr1抗药性有关基因的点突变变化特征。 方法 使用PCR RFLP技术检测基因点突变。 结果 氯喹及与青蒿琥脂伍用治疗前后的所有样本都发现有恶性疟原虫pfcrt基因氨基酸编码 76突变为苏氨酸的特征。但是 ,氯喹治疗前 ,5 0 % pfmdr1基因氨基酸编码 86为天冬酰氨酸 (野生型 ) ,而剩余的 5 0 %为野生型和突变型 (苏氨酸 )的特征。氯喹治疗后 ,在 18个复燃的病例中 ,83 .3 %的 pfmdr1基因 86位点为野生型 ,剩余的 16.7%是混合型。氯喹与青蒿琥脂伍用治疗前 ,3个样本携带混合型基因型 ,剩余的 (86% )为野生型 ,但治疗后 ,所有样本只携带野生型。 结论 这些结果可能支持这样的假说 :pfcrt基因突变起主导作用 ,但 pfmdr1基因突变增强了氯喹抗药性的效果。

云南恶性疟原虫氯喹抗药性基因76位点突变研究

目的研究云南恶性疟原虫氯喹抗药性基因(pfcrt)76位点突变的情况,以及与抗药性表现型的关系。方法应用PCR和限制性酶切片段长度分析方法,检测现症病人干滤纸血样的恶性疟原虫pfcrt基因点突变。结果云南省恶性疟原虫pfcrt基因76位点的突变型很高,占85.0%(51/60);野生型和混合型较少,分别占8.3%(5/60)和6.7%(4/60)。体内法测定的氯喹抗性和敏感样本均有pfcrt76突变型;体外法测定的17份氯喹抗性样本中,有13份带有pf-crt76突变型。结论云南省恶性疟原虫pfcrt基因氨基酸编码76位点突变频度很高。体内和体外法测定的氯喹抗性表现与pfcrt76突变型有较高的一致性。

氯喹抗药性与相关基因Pfmdr1

抗疟药氯喹作为安全、有效、廉价的一线抗疟药物被广泛使用。随着世界各地恶性疟原虫株氯喹抗性的产生,氯喹抗药性的机制研究已成为疟疾研究的重点之一。本文就有关氯喹抗药性与相关基因序列Pfmdr1的研究进展作一综述。

恶性疟原虫海南分离株pfcrt基因同氯喹抗性的相关性分析

目的探讨恶性疟原虫海南株pfcrt基因多态性同氯喹抗性的关系。方法采集确诊恶性疟患者血样42份,应用套式PCR方法体外扩增pfcrt基因含有编码第76和356位氨基酸的基因片段,并对扩增产物进行限制性酶切分析。结果1)76位点:22个氯喹抗性虫株中有18个发生K76T突变型(81.82%),20个氯喹敏感虫株中野生型和突变型各占50%;2)356位点:所有42个样本的356位点均为野生型。结论我国海南省恶性疟原虫pfcrt基因的K76T突变与氯喹抗性存在一定关联,而356位点可能与氯喹抗性无关。

海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因pfcrt多态性分析

目的了解海南省恶性疟原虫产生氯喹抗性是否与pfcrt基因中的关键性点突变有关。方法对45份采自海南省恶性疟患者血样,采用套式PCR法分别扩增pfcrt基因中含有第76位和220位氨基酸的多态性片段,并对扩增产物进行限制性内切酶酶切分析,观察是否存在突变位点。结果45个样本中,pfcrt基因发生K76T点突变的样本有28个,其中20个是抗性株,8个是敏感株;全部样本的pfcrt基因第220位氨基酸均发生A220S点突变。结论我国海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性与发生在pfcrt基因中的K76T点突变有一定的关联。

海南恶性疟原虫分离株Pfcrt和Pfmdr1基因点突变的研究

目的分析海南省恶性疟原虫分离株氯喹抗性转运蛋白编码基因(Pfcrt)及其P-糖蛋白同系物1(Pgh1)编码基因(Pfmdr1)的点突变特征,为探讨抗性分子标记用于氯喹抗性监测提供参考。方法采用巢式PCR(nested-PCR)和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法,检测Pfcrt基因编码第76位氨基酸的密码子和Pfmdr1基因编码第86、1246位氨基酸的密码子发生点突变情况。按世界卫生组织(WHO)推荐的体外微量法测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。结果检测的36份血样中,28份成功扩增Pfcrt基因,导致第76位氨基酸由赖氨酸(K)变为苏氨酸(T)的突变型占64.3%,混合型占14.3%,野生型占21.4%;29份成功扩增Pfmdr1基因,导致第86位氨基酸由天冬酰胺(N)变为酪氨酸(Y)的突变型占3.4%,混合型占6.9%,野生型占89.7%。未发现编码第1246位氨基酸的密码子发生点突变。体外氯喹敏感试验结果显示,72.2%(26/36)分离株存在抗性。治疗前恶性疟原虫Pfcrt76T突变发生率在体外微量测定法显示的氯喹抗性与敏感株中的差异有统计学意义(P<0.05),而Pfmdr1点突变发生率在氯喹抗性与敏感株中的差异无统计学意义(P>0.05)。结论恶性疟原虫Pfcrt基因76T可以作为监测氯喹抗性的一个分子标记。

海南恶性疟原虫pfcrt等位基因多态性的单体型研究

目的建立恶性疟原虫pfcrt(Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter)等位基因多态性的单体型的研究疗法,比较我国海南省与东南亚及非洲地区恶性疟原虫的pfcrt等位基因多态性的单体型的特征。方法来自海南省19份恶性疟滤纸血样提取DNA,通过巢式PCR反应,扩增出包含第72～76、97位密码子的基因片段,根据限制性片段长度多态性(RFLP)分析结果,各选取6份突变型和野生型PCR产物进行DNA测序,检测第72～76、97位密码子序列,从而建立并分析我国海南省恶性疟prcrt等位基因的单体型。结果19份滤纸血样本提取的DNA全部扩增出1条195 bp的片段,酶切消化后,有11份出现1条100 bp左右的酶切片段,为野生型pfcrt等位基因,其余8份为1条195 bp的片段,为突变型。基因序列分析发现,野生型pfcrt等位基因的第72～76位密码子单体型为CVMNK,突变型为CVIET,第97位密码子未发现突变。结论我国海南省氯喹抗药性恶性疟原虫pfcrt等位基因第72～76位密码子的单体型与东南亚和非洲地区抗氯喹恶性疟原虫相应单体型一致。

中缅边境恶性疟原虫Pfcrt基因76位点突变研究

目的检测分析中缅边境恶性疟原虫氯喹抗性基因(pfcrt)及其76位点氨基酸的突变情况。方法采用巢式PCR方法扩增含76位点的pfcrt基因,并对扩增产物进行限制性内切酶及测序分析。结果对恶性疟现症病人血样作pfcrt基因的巢式PCR扩增,目的基因片段(145bp)检出率为74.05%(117/158),对PCR扩增阳性的产物进行RELP分析,检查突变型酶切片段,突变率为95.73%(112/117)。结论恶性疟原虫pfcrt基因可以作为一个分子标记用于监测中缅边境地区恶性疟原虫的氯喹抗性。

伯氏疟原虫氯喹抗性株和敏感株基因组DNA比较研究

目的 比较伯氏疟原虫敏感株 (N株 )和抗性株 (RC株 )基因组DNA差异。 方法 应用基因组DNA随机多态性扩增 (RAPD)和锚定引物扩增DNA(APAD) ,分别对抽提的伯氏疟原虫N株和RC株基因组DNA进行PCR扩增 ,并对扩增的产物进行电泳 ,对结果进行统计分析。 结果 3 7条随机引物RAPD方法扩增出 44 0条DNA条带 ,其中RC株和N株的共有条带是 196条 ,差异带 43条。 84条锚定多聚A引物APAD方法扩增出 95 2条DNA条带 ,其中RC株和N株的共有条带是 43 6条 ,差异带 5 3条。两种方法得到N株和RC株基因组DNA的同源性分别为 0 .89和0 .91;距离系数分别为 0 .197和 0 .15 5。 结论 伯氏疟原虫N株和RC株基因组DNA具有高度同源性。

二氯喹啉酸诱导稗草EcDnaJ基因表达

DnaJ作为分子伴侣在植物抗逆中起重要作用．但目前在二氯喹啉酸逆境下，其在抗药性稗草中表达特点却鲜有报道．本研究采用RACE技术从抗二氯喹啉酸稗草中克隆了1个DnaJ基因，命名为EcDnaJl（GenBank登录号：JX518598），其cDNA全长为2154bp，开放阅读框为1350bp．编码449个氨基酸，理论分子量为48．4kD，等电点为9．5．该蛋白质氮端含有1个保守的J结构域，中部含有4个模式为CxxCxGxG的锌指结构．Real—timePCR分别测定EcDnaJl在二氯喹啉酸抗性和敏感的稗草生物型苗期叶、根及成株期根、茎、叶和种子中的表达，在感、抗生物型的相对表达量分别是0．8～20．9和7．4～30．2，其中在抗性稗草苗期叶片中相对表达量最高为30．2，而在敏感稗草种子中最低为0．8，抗性稗草是敏感稗草的1．4～9．2倍．受二氯喹啉酸诱导后，其在感、抗稗草的相对表达量分别为35．8～72．5和84．9～261．9，在抗性稗草苗期叶片中相对表达量最高为261．9，而在敏感稗草的种子中相对表达量最低为35．8，抗性稗草是敏感稗草的2．4～3．6倍．诱导前后，无论是在苗期根和叶中还是成株期的根、茎、叶和种子中，EcDnaJl表达量均是抗性稗草高于敏感稗草．抗、感稗草生物型的EcDnaJl在mRNA水平差异表达暗示，它可能参与了稗草对二氯喹啉酸的抗药性．

云南省恶性疟原虫多药抗性基因^(Asn)86^(Tyr)多态性调查

目的检测云南恶性疟原虫多药抗性基因 (Pfmdr1 ) Asn 86Tyr的多态性 ,探索其与氯喹敏感性表现型的关系。方法用等位基因特异 PCR和限制性酶切片段长度分析技术 (AS-PCR/RFLP)。结果在 86% (1 9/2 2 )的氯喹抗性分离株中检测到 Pfmdr1基因的 Asn86Tyr两种多态性 ,携带编码 86Tyr多态变异的占 50 % ,而含编码 Asn86多态的也是 50 %。结论在云南氯喹抗性高度流行区 ,Pfmdr1基因

恶性疟原虫氯喹抗性的研究进展

恶性疟原虫氯喹抗药性的产生是一个多基因、多因素作用的复杂过程。该文通过对恶性疟原虫氯喹抗性产生机制以及与抗性相关的pfmdr1基因、pfcrt基因和cg2基因等的研究进展进行综述。探讨氯喹抗性产生的机制，为恶性疟原虫氯喹抗性机制的研究及新药设计提供参考。

酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性的研究

目的研究酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性,及其增效机制。方法恶性疟原虫氯喹抗性株(FccSM1/yN株)取自云南省思茅地区恶性疟患者静脉血,经同步化处理,用新鲜血将红细胞感染率调至0.5%～1.0%,红细胞压积与培养基体积比(红细胞比容)为1∶9,混匀。制备氯喹药板及氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)组合药板。氯喹药板自上而下每行氯喹终浓度依次为0.3125～2560nmol/L,呈2倍递增。氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)组合药板,是在氯喹药板基础上加入酮替芬(或赛庚啶),每行10孔自左至右终浓度依次为9.77～5000nmol/L,呈2倍递增,每块药板均设A行空白对照。每孔加混匀血样50μl,37℃培养34h,镜检计数每200个疟原虫中含3个核以上裂殖体数,计算氯喹单药及各配伍组对恶性疟原虫的半数抑制浓度(IC50),以及酮替芬(或赛庚啶)提高氯喹活性的指数(AEI)。选择AEI值较高的配伍组,进行增效时序性研究。当氯喹对虫体作用0～10h分别加入酮替芬(或赛庚啶),34h后检测和计算各时间段IC50及AEI。选择氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)最佳配伍剂量,培养恶性疟原虫20h,提取总RNA,用实时荧光定量PCR(real-timePCR)分析药物作用前后恶性疟原虫氯喹抗性转移基因(pfcrt)和多药抗性基因(pfmdr1)表达水平。结果0.3125～2560nmol/L氯喹与625nmol/L酮替芬(或赛庚啶)配伍,增效作用显著,氯喹/酮替芬的IC50为74.53nmol/L,AEI为0.42;氯喹/赛庚啶的IC50为89.70nmol/L、AEI为0.30。5nmol/L氯喹作用6～7h加入625nmol/L酮替芬(或赛庚啶),增效作用显著,氯喹/酮替芬的IC50为67.70nmol/L、AEI为0.47;氯喹/赛庚啶的IC50为81.53nmol/L、AEI为0.37。5nmol/L氯喹与625nmol/L酮替芬(或赛庚啶)配伍,作用20h,氯喹/酮替芬可使pfcrt基因表达水平升高91%,而氯喹/赛庚啶可使pfmdr1基因表达水平下降14%。结论体外氯喹与适量的酮替芬(或赛庚啶)配伍,能增强恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹的反应性。氯喹对虫体作用6～7h加入酮替芬(或赛庚啶)增效作用显著。该增效作用与pfcrt基因和pfmdr1基因的表达水平有关。

恶性疟原虫pfcrt基因K76T与氯喹抗性的相关分析-Meta分析

目的采用meta分析的方法探讨pfcrt K76T、与恶性疟氯喹抗性相关性。方法检索主要的医学数据库，按一定的人选和排除标准筛选相关文献，共纳入11项研究结果，采用Rev Man5对pfcrt K76T与恶性疟原虫氯喹抗性的关系进行meLa分析。结果pfcrt K76T与恶性疟氯喹抗性具有明显相关性，有统计学意义（OR=6．60，95％（CI=3．46～12．59，Z=5．73，P〈0．00001）。结论pfcrt K76T与恶性疟氯喹抗性具有明显相关性，应进一步研究，为抗疟疫苗、抗疟药物的研究和分子诊断提供科学依据。

恶性疟原虫抗药性基因研究现状

目前恶性疟原虫几乎对所有抗疟药物都产生了抗药性,研究与恶性疟原虫抗药性相关的恶性疟原虫氯喹抗药转运蛋白基因(Pfcrt)和恶性疟原虫多药抗药性基因(Pfmdr1)以及恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因(K13)突变有助于建立快速有效的疟原虫抗药性分子监测技术,对实现全球消除疟疾目标有着重要的意义。本文对恶性疟原虫药物抗性基因研究现状进行了综述。

伯氏疟原虫抗本芴醇株抗性转化相关基因的克隆

目的 :研究药物敏感虫株伯氏疟原虫K173株及其在本芴醇压力下产生的本芴醇抗性株之间基因表达的差异状况 ,克隆抗性相关基因。方法 :采用mRNA差异显示技术寻找相关基因 ,并用Northern杂交证实。结果 :采用 2 4种引物组合进行mRNA差异显示 ,克隆到 30余个差异表达基因片段 ,对其中 8个进行了Northern杂交鉴定及测序。结果表明 ,与敏感株相比 ,克隆CB52在本芴醇抗性株中表达明显增多 ,而在氯喹抗性株中的表达有所减少 ,说明克隆CB52确与本芴醇抗性相关 ,序列同源性检索表明CB52序列与恶性疟原虫环亲蛋白基因有微弱同源性。向GenBank登录 8条新基因序列。结论 :克隆CB52基因表达水平的改变与伯氏疟原虫本芴醇抗性的产生相关 。