氯甲基苯甲酰氨荧光染料用于羊骨髓基质干细胞标记和心肌内示踪动物实验

目的探讨氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-Di I)标记羊骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)进行心肌内移植示踪的可行性。方法羊BMSCs经CM-Di I标记后(D-BMSCs),体外传代培养观察荧光变化;D-BMSCs细胞悬液经心肌内直接注射于心梗区和梗死移行区,观察示踪有效性。结果 CM-Di I可高效标记羊BMSCs。D-BMSCs在荧光显微镜下呈橙红色。体外培养证实D-BMSCs保持骨髓基质干细胞特异细胞形态,并在传2代后仍保持较强荧光。流式细胞术分析表明D-BMSCs与BMSCs增殖能力没有差异;三系分化证实D-BMSCs与BMSCs分化潜能相当。心肌内植入1周,D-BMSCs在荧光显微镜下发红色荧光,清晰显示其在心脏中的位置和细胞形态。结论 CM-Di I可用于羊BMSCs标记和心肌内移植示踪。

氯甲基苯甲酰氨标记骨髓间充质干细胞在免疫介导骨髓衰竭小鼠模型体内的归巢

背景:再生障碍性贫血是T淋巴细胞免疫亢进破坏造血干祖细胞的一种异常免疫反应性疾病。骨髓间充质干细胞具有支持造血功能同时具有免疫调控作用。目的:观察骨髓间充质干细胞移植骨髓衰竭模型小鼠体内的归巢情况。方法:将BALB/c小鼠随机分成正常对照组、骨髓衰竭模型组和骨髓间充质干细胞移植组,于第6天将已标记氯甲基苯甲酰氨的BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞经尾静脉注射途径移植给骨髓衰竭模型小鼠,采用流式细胞术和组织学荧光显微镜观察标记细胞在不同组织的动态分布。造模第14天,观察各组小鼠的平均生存时间、外周血血象和骨髓形态学特征。结果与结论:骨髓间充质干细胞经尾静脉输注后24h在受体小鼠骨髓中可发现氯甲基苯甲酰氨阳性标记细胞,72h时阳性标记细胞数量增多(P<0.05)。骨髓间充质干细胞移植组小鼠濒死或处死前的白细胞、血红蛋白、血小板、骨髓单个核细胞数与模型组小鼠濒死时相比显著升高(P<0.01)。骨髓衰竭模型组比骨髓间充质干细胞移植组平均生存时间短(P<0.05)。结果证实,骨髓间充质干细胞输入骨髓衰竭模型体内能归巢至骨髓,促进造血恢复,减轻骨髓衰竭程度,显著延长生存时间。

基于(+)-二对甲基苯甲酰-D-酒石酸和铜(Ⅱ)构筑的配位聚合物的结构、热稳定性、荧光和染料吸附性质

合成了一种配位聚合物{[Cu(HDTTA)_(2)(DMF)(H_(2)O)]·DMF·H_(2)O}_(n)(1)(D-H_(2)DTTA=(+)-二对甲基苯甲酰-D-酒石酸,DMF=N,N-二甲基甲酰胺)。通过红外光谱、元素分析、X射线单晶衍射和粉末衍射表征了配合物1的结构。配合物1沿a轴为一维链状结构,在ab平面通过弱相互作用形成二维层状结构。热稳定性研究表明配合物1的主结构可在197℃以下稳定存在。在300 nm激发波长条件下,配体的荧光由于和Cu^(2+)离子配位而猝灭。配合物1对水溶液中亚甲基蓝染料表现出良好的特异性吸附效果,作用49 min后吸附率可达81%。

荧光活性染料(CM-Dil)对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的:体外分离、培养人骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells,hBMSCs),探讨应用不同浓度氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-Dil)对hBMSCs增殖力的影响。方法:采用Ficoll梯密度离心法分离、培养hBMSCs,并促进其分别向成骨细胞、脂肪细胞分化;应用不同浓度CM-Dil分别标记第3代hBMSCs,观察不同浓度标记下细胞的荧光强度、标记效率、活性和增殖能力。结果:采用Ficoll梯密度离心法获得的hBMSCs,成骨、成脂分化染色阳性。不同浓度CM-Dil(5、10、20、30μmol/L)在30 min内均可成功标记hBMSCs,24 h后观察标记效率均达到98%以上(P>0.05)。直到20μmol/L的标记浓度对细胞的活力、增殖能力仍没有影响(P>0.05)。结论:CM-Dil是一种简便、安全的标记骨髓间充质干细胞的方法。

氯甲基苯甲酰氨和5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷标记示踪大鼠脂肪干细胞的研究

目的比较研究氯甲基苯甲酰氨（CM-Dil）和5-乙炔基-2＇-脱氧尿嘧啶核苷（EdU）对大鼠脂肪干细胞（ADSCs）的体外标记示踪效果，为ADSCs移植治疗勃起功能障碍体内研究寻找最佳的干细胞示踪剂。方法分离和培养sD大鼠ADSCs，分别采用10μmol／LCM-Dil荧光活性染料和50μmol／LEdU标记第4代ADSCs，并通过流式细胞术和荧光显微镜检测标记后第7、14、21、28天细胞阳性率。结果CM-Dil和EdU两者对ADSCs生物学特性均无明显影响。CM-Dil标记ADSCs阳性率达（99．6±0．2）％，第21天后荧光开始衰减，第35天细胞阳性率仍达（64．2＋3．3）％；EdU标记ADSCs阳性率为（87．1±1．8）％，7d后细胞阳性率逐渐降低，第14天后急剧降低，第28天细胞阳性率为（14．4±2．7）％。结论CM-Dil和EdU两者均适用于ADSCs标记示踪，CM-Dil标记具有操作简单、标记阳性率高、荧光持久等优点，适用于长期标记示踪，EdU仅适用于短期标记示踪。

磁性荧光双标人骨髓间充质干细胞归巢至大鼠急性损伤肝组织示踪显像

目的观察磁粒子和荧光染料双标人骨髓间充质干细胞归巢至大鼠急性损伤肝组织的示踪。方法以超顺磁性氧化铁(SPIO)和氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)标记永生化人骨髓间充质干细胞(UE7T-13)。普鲁士蓝染色检测细胞内铁,荧光显微镜和流式细胞仪检测CM-Dil标记阳性率。建立12只急性肝损伤大鼠模型,分为实验组(n=6)和对照组(n=6),将标记细胞经尾静脉移植入实验组大鼠,未标记细胞移植入对照组大鼠。分别于移植前3h、移植后3h、3天、5天、7天应用MR T2*W、T2*map对大鼠活体成像,获得肝脏R2*值。并与肝脏组织切片普鲁士蓝染色和CM-Dil荧光表达情况对照。结果双标细胞的SPIO-PLL标记率接近100%,流式细胞仪检测CM-Dil标记阳性率达99.97%。实验组细胞移植后3天、5天肝脏R2*值均较移植前明显升高(t=7.282、7.608,P均<0.01),对照组细胞移植后各时间点与移植前比较,R2*值差异均无统计学意义(F=0.99,P>0.05)。普鲁士蓝阳性细胞主要分布于肝小叶中央静脉周围病变区,荧光显微镜下观察红色荧光阳性细胞与普鲁士蓝阳性细胞分布基本一致。结论 SPIO和CM-Dil可有效标记人永生化骨髓间充质干细胞(UE7T-13),不影响细胞增殖能力,临床应用型1.5T MR可对磁粒子标记的UE7T-13进行肝归巢活体示踪,CM-Dil有助于证实存活干细胞的肝内定植。

地西泮的合成工艺优化研究

在地西泮的合成研究中,分别对碳酸氢铵、碳酸铵和HA这三种环合剂做了比较,通过实验发现,碳酸氢铵环合剂在地西泮合成中效果和收率较好。在进一步实验中通过调整2-(N-甲基氯乙酰氨)-5-氯二苯甲酮和碳酸氢铵的物质量比、反应温度和反应时间,找到最佳的合成条件。结果表明,反应温度为52℃,反应时间为7 h,对地西泮的合成产率有着显著的影响,当2-(N-甲基氯乙酰氨)-5-氯二苯甲酮和碳酸氢铵的物质量比为1∶6时,地西泮的合成收率最高。在结果可靠性验证实验中,进行了三次重复实验,合成收率分别为84.8%、84.7%和84.9%,进一步表明在该工艺条件下,合成地西泮收率是相对稳定和可靠的。

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗大鼠急性肝衰竭(ALF)的机制,并示踪MSCs在ALF大鼠体内的分布、迁移。方法①以流式细胞仪检测hrGFP慢病毒感染的UE7T-13细胞株(hrGFP-MSCs)和氯甲基苯甲酰氨(CM-DiI)标记MSCs(MSCs-DiI)的绿色荧光蛋白阳性表达率或红色荧光染料标记阳性率。②CCK-8体外检测MSCs、hrGFP-MSCs和MSCs-DiI的细胞增殖情况。③取SD大鼠38只,建立急性肝损伤模型,30只造模成功,随机分为3组:CCL4组(A组)、CCL4/hrGFP-MSCs组(B组)和CCL4/MSCs-DiI组(C组)。B组和C组造模12 h肝内注射MSCs悬液。④分别于造模24 h、72 h、7天取肝组织以及肺组织观察移植hrGFP-MSCs、MSCs-DiI分布、迁移情况。造模后72 h,检测血清IL-10,TNF-α炎症因子水平,另取肝组织行PCNA免疫组化染色。结果①hrGFP-MSCs的hrGFP表达阳性率达99.21%,MSCs-DiI的CM-DiI标记率为99.98%。②CCK8检测示MSC-DiI、hrGFP慢病毒标记MSCs均不影响其增殖能力。③冰冻切片示CM-DiI标记MSCs可更好地示踪移植细胞,造模24 h、72 h及7天非注射部位肝组织和肺组织MSCs-DiI均可见散在的移植细胞团,而hrGFP-MSCs未见明确荧光阳性细胞。④MSCs治疗ALF大鼠模型下调了系统性炎症应答,造模72 h A组的TNF-α、IL-10水平大于B组及C组;PCNA示MSCs治疗促进了宿主肝细胞增殖。结论 CM-DiI标记MSCs能更好地示踪少量散在的移植细胞。异种移植MSCs可通过下调系统性炎症应答,促进肝细胞增殖,修复ALF大鼠肝组织。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及CM-Dil标记的脑内示踪

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离和培养方法 ,并探讨采用氯甲基苯甲酰胺(CM-Dil)对BMSCs进行体外标记和体内示踪的可行性。方法全骨髓贴壁法分离获取BMSCs,收集第3代细胞,流式细胞术检测CD34、CD44和CD29的表达率。加入CM-Dil对BMSCs进行体外标记,荧光倒置显微镜下观察24h、21d和30d时的标记情况,通过描绘生长曲线明确CM-Dil对体外培养BMSCs生长特性的影响。制作局灶性脑缺血大鼠模型,将CM-Dil标记的BMSCs立体定向移植至大脑纹状体区,于移植后7、14、21d取脑组织制备冰冻切片,荧光显微镜下观察标记细胞在脑内的存活及分布情况。结果 BMSCs贴壁培养至第3代后呈成纤维细胞样,形态均一、排列有序,CD34、CD44和CD29表达率分别为1.71%、80.32%和84.89%。体外CM-Dil标记24h的BMSCs发出红色荧光,标记率为100%;21d后,经传代培养的BMSCs荧光强度与24h时点相近,但30d后荧光有所淬灭。标记后细胞的生长、增殖特性未受影响,形态无改变。脑组织冰冻切片发现移植的BMSCs在7、14、21d时主要位于针道附近,并向周围扩散,数量逐渐减少,呈椭圆形或不规则形。结论通过贴壁培养可以从大鼠骨髓中分离培养出较纯的BMSCs。CM-Dil染色简单、有效、无细胞毒性,体外标记BMSCs的最长时限为21d,可作为BMSCs脑内定向移植的体内示踪方法 。

不同途径移植人脐带间充质干细胞对大鼠肝脏缺血-再灌注损伤修复研究

目的探讨不同途径移植人脐带间充质干细胞(HU-MSCs)对大鼠肝脏缺血-再灌注损伤(HIRI)的修复效果。方法将40只雄性SD大鼠随机分为A组(对照组)、B组(模型组)、C组(门静脉移植干细胞组)、D组(尾静脉移植干细胞组),每组10只,B、C、D组采用Pringle法建立HIRI模型,其中B组不予进行干细胞移植,C组和D组分别经门静脉、尾静脉移植氯甲基苯甲酰氨(CM-DiL)标记的HU-MSCs 106个。分别于术前、移植后第1、3、5日抽血检测丙氨酸转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;移植后第5日处死各组大鼠,肝脏取材行苏木素-伊红(HE)及dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色观察肝脏损伤情况,在激光共聚焦显微镜下观察HU-MSCs在各组大鼠肝脏分布情况。结果干细胞移植后C、D组ALT水平较B组降低,且C组ALT水平低于D组(均为P<0.05);C、D组炎症因子TNF-α水平明显低于B组,且与D组相比,C组下降更显著(均为P<0.05)。肝组织HE染色提示B组肝脏损伤最严重,C组肝脏损伤轻于D组。肝组织TUNEL染色结果显示,C、D组的凋亡指数(AI)低于B组,且C组较D组低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。激光共聚焦显微镜下可见,移植后C组与D组均可见CM-DiL标记的HU-MSCs,且C组的HU-MSCs数量高于D组(P<0.05)。结论移植HU-MSCs能减轻HIRI,且门静脉移植效果优于尾静脉移植效果。

CM-Dil标记人牙龈间充质干细胞在大鼠颅骨缺损修复模型中的示踪研究

目的:探讨氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)荧光染料体外标记人牙龈间充质干细胞(hGMSCs)对其增殖、分化能力的影响以及在体内荧光标记持续时间。方法:组织块法原代培养hGMSCs,采用流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物,然后以CM-Dil标记hGMSCs,CCK-8检测标记后细胞的增殖;标记及未标记的细胞进行成骨及成脂诱导培养21 d后,分别进行茜素红染色和油红O染色。大鼠颅骨缺损实验检测CM-Dil标记的hGMSCs体内标记效果。结果:原代培养的hGMSCs高表达CD105、CD90和CD73,而阴性表达CD14、CD34、CD19、CD45和人类白细胞DR抗原(HLA-DR),符合间充质干细胞表面特征。与对照组相比,CM-Dil并不影响hGMSCs的增殖和成骨、成脂分化能力(P>0.05)。体内移植的CM-Dil标记hGMSCs在第8周时仍可检测到红色荧光。结论:CM-Dil在体外标记hGMSCs不会影响hGMSCs的干细胞特性,且体内标记时间长达8周,可作为干细胞体内标记示踪的方法之一。

冻存对CM-Dil标记脐带间充质干细胞的影响

目的 考察用氯甲基苯甲酰氨（CM-Dil）标记人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）的可行性及冻存对CM-Dil标记的hUCMSCs的影响.方法 采用组织块法体外培养hUCMSCs,观察细胞形态及生长情况,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型来鉴定该细胞.将第3代hUCMSCs用CM-Dil标记,观察细胞形态及生长情况,用荧光显微镜观察体外标记情况,并将细胞冻存、复苏,观察细胞复苏后的生长情况及荧光标记情况.结果 hUCMSCs形态类似成纤维细胞,呈梭形、多角形.第3代hUCMSCs强表达CD44、CD29、CD90和CD73,不表达CD34和CD45.CM-Dil标记hUCMSCs的细胞标记率达90％以上,染料主要存在于细胞膜;标记后细胞生长状态良好,冻存及复苏后细胞仍有较强荧光表达,且细胞生长状态良好.结论 CM-Dil标记hUCMSCs示踪方法简单易行,冻存对CM-Dil标记的hUCMSCs的生长无明显影响.