氯离子转运蛋白NKCC1在老年小鼠术后认知功能障碍中的作用

目的探讨氯离子转运蛋白钠离子钾离子氯共转运体1(NKCCl)在老年小鼠术后认知功能障碍(POCD)中的作用。方法选择老年雄性C57BL/6小鼠40只,18~20月龄,体重28~32 g。将小鼠随机分为四组:对照+生理盐水组(N组),对照+布美他尼(NKCC1抑制剂)组(B组),POCD模型+生理盐水组(M组)和POCD模型+布美他尼组(MB组),每组10只。采用异氟醚麻醉和剖腹探查术建立POCD动物模型,于术后3~7 d行旷场与条件恐惧实验评估认知功能;行为学结束后采用Western blot法检测海马组织NKCC1、钾离子氯离子共转运体2(KCC2)、脑源性神经营养因子(BDNF)及突触后密度蛋白95(PSD95)的蛋白含量,免疫组织荧光检测海马组织CA1、CA3、DG区NKCC1免疫荧光强度。结果与N组比较,M组场景僵直时间明显缩短(P<0.05),海马NKCC1蛋白含量明显升高(P<0.05),BDNF、PSD95蛋白含量明显降低(P<0.05),海马组织CA1、CA3、DG区NKCC1免疫荧光强度明显增强(P<0.05)。N组和B组各指标差异均无统计学意义。与M组比较,MB组场景僵直时间明显延长(P<0.05),海马NKCC1蛋白含量明显降低(P<0.05),BDNF、PSD95蛋白含量明显升高(P<0.05),海马组织CA1、CA3、DG区NKCC1免疫荧光强度明显减弱(P<0.05)。结论NKCC1可能在老年小鼠POCD中发挥关键作用,其机制可能与突触相关蛋白BDNF与PSD95表达水平下调有关。

皮质发育障碍模型大鼠海马区阳离子-氯离子转运体基因表达变化的研究

目的探讨阳离子-氯离子转运体 NKCC1(内向 Na^+,K^+-2Cl^-协同运输)、KCC2(外向K^+-Cl^-协同运输)mRNA 在皮质发育障碍致痫机制中的作用。方法在 SD 大鼠孕17 d 腹腔内注入卡莫司汀(BCNU)制作皮质发育障碍模型;Nissl 染色观察 P60 d 仔鼠病理变化;P60 d 用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测两组雄性仔鼠海马区 NKCC1、KCC2 mRNA 的表达。结果 Nissl 染色湿示海马区域异位细胞异常聚集。实验组海马区 NKCC 1mRNA 表达明显上调(NKCC1/肌动蛋白的比值,实验组0.70±0.13、对照组0.48±0.09,P<0.01),KCC2 mRNA 表达明显下调(KCC2/肌动蛋白的比值,实验组0.54±0.10、对照组0.81±0.15,P<0.01)。结论 NKCCl mRNA 上调和 KCC2mRNA 下调的共同作用可能与皮质发育障碍致痫密切相关。

电针对神经病理性疼痛大鼠痛觉过敏及脊髓背角钾-氯离子协同转运体2表达的影响

目的:观察患侧电针和健侧电针足三里穴、阳陵泉穴对神经病理性疼痛大鼠行为学表现以及脊髓背角钾-氯离子协同转运体2(KCC2)表达的影响,探讨患侧选穴和健侧选穴两种针刺方案的镇痛效应,以及KCC2在电针镇痛效应中的作用。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为4组:假模组、模型组、患侧电针组、健侧电针组,每组10只。建立大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型,治疗组于术后1周开始电针治疗,每天1次,连续7天。各组于术前(0天)及术后3、5、7、10、12、14天分别测量大鼠患侧足机械足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)。术后14天处死大鼠,取脊髓组织行HE染色观察组织病理学改变,并采用免疫组化方法检测脊髓背角KCC2蛋白的表达。结果:与术前比较,CCI各组大鼠痛阈明显降低,出现痛觉过敏(P<0.001),电针治疗后大鼠MWT和TWL均有不同程度的持续升高,且患侧与健侧电针相比无明显差异。HE染色结果提示,患侧电针组与健侧电针组脊髓背角组织及神经元病变程度较模型组减轻。术后14天患侧与健侧电针组较模型组脊髓背角患侧KCC2表达显著增加(P<0.05),并且患侧电针组与健侧电针组无明显差异。结论:患侧电针和健侧电针能产生类似的镇痛效果,均可减轻外周神经损伤后引起的痛觉过敏。患侧电针与健侧电针治疗均可抑制KCC2蛋白的表达下调,电针的镇痛作用可能是通过增加脊髓背角中KCC2的表达实现的。

高盐饮食对更年期焦虑小鼠海马钾离子-氯离子共转运体2、钠-钾-氯离子失转运体1表达的影响

目的研究高盐饮食对更年期焦虑症小鼠钾离子-氯离子共转运体2(KCC2)、钠-钾-氯离子共转运体1(NKCC1)表达的影响。方法将大鼠随机分为空白组、模型组、4%高盐饮食组、8%高盐饮食组。其中4%高盐饮食组、8%高盐饮食组经高盐饮食干预1个月后,HE染色观察脑部结构,免疫组织化学观察KCC2、NKCC1表达情况。结果高盐饮食使更年期焦虑小鼠海马区锥体细胞排列紊乱,神经元数目明显减少,细胞轮廓模糊,出现大量的空泡现象,细胞形态不规则,细胞间隙明显增大;模型组KCC2表达的阳性细胞明显减少,高盐饮食组阳性细胞极少;模型组NKCC1表达阳性细胞明显增多,高盐饮食组阳性细胞增多更明显。结论高盐饮食加重更年期焦虑症的发生可能与KCC2及NKCC1之间的动态平衡被打破有关。

成年大鼠小脑Purkinje神经元不表达神经元特异性的钾离子氯离子共转运体2

目的:观察神经元特异性标记物钾离子氯离子共转运体2(KCC2)在成年大鼠小脑皮质的表达。方法:成年SD大鼠,4%多聚甲醛灌注固定,取脑,冷冻切片,KCC2和小脑Purkinje神经元标记物Calbindin-D28K在小脑的免疫荧光双标,激光共聚焦显微镜观察。结果:KCC2在颗粒细胞层神经元有丰富的表达,但在Purkinje神经元表达很弱。结论:神经特异性的KCC2可能不是成年大鼠的Purkinje神经元的离子型γ-氨基丁酸受体发挥抑制性作用的主要因素。

运动训练对脊髓损伤后痉挛大鼠脊髓内钾-氯离子协同转运体2表达的影响

目的:研究运动训练对脊髓损伤(SCI)后痉挛大鼠行为学表现及脊髓内钾-氯离子协同转运体2(KCC2)表达的影响,探讨KCC2在运动训练的解痉效应中的作用。方法:将30只雌性SD大鼠随机分为假手术组、对照组、实验组。采用改良Allen撞击法建立脊髓损伤后痉挛模型,使用BBB评分、Ashworth评分来评估三组大鼠术后行为学变化,并于术后5周用免疫组化技术检测各组大鼠损伤远段脊髓KCC2表达。结果:假手术组术后行为学评分一直保持正常。术后1d—5周,对照组和实验组的BBB评分均持续升高,且2组组内不同时间点的BBB评分差异均有显著性意义(P<0.05)。术后2—5周,实验组评分均高于对照组,且差异均有显著性意义(P<0.05)。对照组和实验组在术后1周左右出现痉挛,后痉挛程度逐渐加重,至术后5周左右降低,2组组内不同时间点的Ashworth评定结果差异均有显著性意义(P<0.05)。术后3—5周,对照组评定等级均高于实验组,差异有显著性意义(P<0.05)。三组大鼠脊髓运动神经元胞膜上KCC2表达水平比较,组间差异有显著性意义(P<0.05)。与假手术组相比,其余两组大鼠KCC2蛋白表达下调(P<0.05);与对照组相比,实验组能够明显上调KCC2蛋白的表达(P<0.05),但仍低于假手术组(P<0.05)。结论:运动训练可以促进脊髓损伤后运动功能恢复,有效缓解痉挛,并可抑制KCC2表达的下调,运动训练的解痉效应可能是通过增加KCC2表达实现的。

阳离子-氯离子联合转运蛋白抑制剂对氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影响及对其海马凋亡的影响

目的探讨阳离子-氯离子联合转运蛋白(CCC)抑制剂对氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影响及对其海马凋亡的影响。方法选取幼年SPF级昆明种小鼠60只,随机分为两组,其中对照组30只,实验组30只,予100 mg/kg氯胺酮腹腔注射,待小鼠翻正反射消失,反复腹腔注射100 mg/kg氯胺酮,维持麻醉时间为6 h后,予实验组小鼠布美他尼溶液100μg/kg腹腔注射,同时予对照组等量的生理盐水腹腔注射。对比两组小鼠的苏醒时间、海马区细胞凋亡密度以及海马区NMDA-2B受体表达情况。结果实验组小鼠的苏醒时间明显短于对照组(P<0.05);高倍镜下观察显示体积较正常细胞小者为凋亡细胞,其细胞核内含紫蓝色或黑色的凋亡小体,实验组凋亡细胞明显少于对照组;实验组凋亡细胞密度与对照组比较明显较低(P<0.05);免疫组化法检测显示NMDA-2B受体阳性细胞染色呈棕黄色,多位于CA3区海马组织,分布均匀,与对照组比较,实验组的阳性细胞数目明显较少;Western印迹法测定结果显示,实验组小鼠的NMDA-2B受体灰度值明显低于对照组(P<0.05)。结论 CCC抑制剂对氯胺酮麻醉模型小鼠具有催醒作用,能够明显抑制其海马细胞凋亡,对临床具有指导意义,值得临床推广。

大鼠视上核和室旁核神经元钾离子氯离子共转运体2表达探讨

目的观察神经元特异性标记物钾离子氯离子共转运体2在成年大鼠下丘脑视上核和室旁核的表达。方法成年SD大鼠,4%多聚甲醛灌注固定,取脑,冰冻切片,下丘脑部进行钾离子氯离子共转运体2和神经细胞核抗原免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察。结果钾离子氯离子共转运体2在视上核和室旁核神经元中表达很弱。结论下丘脑视上核和室旁核部分神经元缺少神经特异性的钾离子氯离子共转运体2表达。

钾-氯离子协同转运体2与癫痫

钾-氯离子转运体2仅在中枢神经系统表达,具有神经元特异性。KCC2在维持神经元内氯离子的浓度发挥重要的作用,它主要调节细胞内Cl-的外向流量,使神经元内氯离子浓度低于它的电化学平衡单位,使γ-氨基丁酸能神经元发生超级化的突触后抑制性反应。KCC2在癫痫发病过程中具有重要的作用,在神经元内KCC2的表达减少,使细胞内Cl-增加,改变了神经元内Cl-的稳态,改变γ-氨基丁酸的突触后抑制性电位,GABA能反应向去极化方向转换,促进癫痫发生与发展。

钾-氯离子协同转运体2信号通路与神经病理性疼痛的关系

神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)由神经炎症所诱发,主要表现为慢性疼痛和疼痛感觉异常等,常引发焦虑、抑郁和社交障碍,发病率也呈逐年上升态势。神经病理性疼痛发病机制复杂,其中钾-氯离子协同转运体2(K+-Cl-cotransporter 2,KCC2)是调节神经病理性疼痛的重要信号分子,也是神经病理性疼痛的治疗靶点。同时,神经病理性疼痛的干预手段也较局限,而运用电针治疗由选择性坐骨神经分支损伤(Spared nerve injury,SNI)诱导的神经病理性疼痛已得到广泛认可,但其具体作用的分子路径尚不明确。本文对KCC2信号通路与神经病理性疼痛的关系进行综述,为进一步探讨KCC2信号通路是否可能参与电针治疗神经病理性疼痛的过程提供理论依据。

APP/PS1小鼠嗅球神经元的早期树突分支和长度及钾-氯离子共运转体2蛋白表达异常

目的探讨嗅球(OB)神经元的形态和相关蛋白的变化,探讨导致阿尔茨海默病(AD)嗅觉功能障碍的原因。方法采用高尔基-考克斯(Golgi-Cox)染色技术评估AD模型小鼠(APP/PS1小鼠)的OB和前梨状皮质(aPC)的神经元形态变化;使用Sholl分析对神经元的形态学进行测量;采用Western blotting检测蛋白质表达水平。结果高尔基-考克斯染色结果显示,在3~5月龄,该模型鼠尚未表现出AD的病理特征及认知障碍时,OB已经发生神经元树突长度和分支数量的显著减少。Western blotting检测发现,对神经元形态和突触功能至关重要的钾-氯离子共转运体2(KCC2)蛋白表达在3~5月龄APP/PS1小鼠的OB中显著降低。结论异常的神经元形态和KCC2信号途径改变可能是AD早期嗅觉功能障碍的基础;维持KCC2信号正常有望成为干预AD早期嗅觉异常的有效途径之一。

阳离子-氯离子共转运体KCC2、NKCC1在对氯苯丙氨酸致急性失眠大鼠模型脑干中的表达

目的探讨阳离子-氯离子共转运体KCC2、NKCC1在大鼠急性失眠发生机制中的作用。方法SD大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸（PCPA）制作急性失眠大鼠模型，同步设立生理盐水对照组和地西泮干预组，每组6只；用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫印迹（Western blot）检测各组大鼠脑干KCC2、NKCC1的表达；用氯离子荧光探针（MQAE），结合激光共聚焦显微镜观察脑干组织细胞内氯离子浓度（[C1-]i）。结果（1）模型组和干预组的KCC2 mRNA及蛋白表达均低于对照组（mRNA丰度值：0．196±0．021比0．939±0．109，P〈0．05；0．485±0．026比0．939±0．109，P〈0．05；蛋白相对值：0．363±0．058比0．967±0．155，P〈0．05；0．663±0．106比0．967±0．155，P〈0．05）；干预组高于模型组（mRNA丰度值：0．485±0．026比0．196±0．021，P〈0．05；蛋白相对值：0．663±0．106比0．363±0．058，P〈0．05）。（2）模型组的NKCC1 mRNA及蛋白表达稍高于对照组，但差异无统计学意义（mRNA丰度值：0．344±0．026比0．320±0．019，P〉0．05；蛋白相对值：0．244±0．010比0．230±0．021，P〉0．05）；干预组较对照组和模型组降低（mRNA丰度值：0．066±0．031比0．320±0．019，P〈0．05；0．066±0．031比0．344±0．026，P〈0．05；蛋白相对值：0．131±0．012比0．230±0．021，P〈0．05；0．131±0．012比0．244±0．010，P〈0．05）。（3）模型组的[Cl-]i高于对照组和干预组（相对值：0．0315±0．0039比0．0164±0．0019，P〈0．05；0．0315±0．0039比0．0182±0．0013，P〈0．05）；干预组稍高于对照组，但差异无统计学意义（相对值：0．0182±0．0013比0．0164±0．0019，P〉0．05）。结论（1）脑干KCC2表达下调及[Cl-]i的升高可能参与大鼠急性失眠的病理机制；（2）地西泮可能通过上调KCC2和下调NKCC1的表达，进而降低[Cl-]i而发挥镇静催眠作用。

钾-氯离子协同转运蛋白2在神经系统疾病中的研究进展

钾-氯离子协同转运蛋白2（KCC2）大量表达于哺乳动物成熟神经元中。众多研究表明KCC2与多种神经系统疾病的发生机制密切相关，从而广受关注。本文将综述KCC2在神经系统疾病中的最新研究进展。

胰岛素样生长因子-2对子宫颈癌细胞表面钾氯离子协同转运子表达的影响

目的研究子宫颈癌Caski细胞株中,胰岛素样生长因子-2(IGF-2)刺激细胞增殖的同时,对钾氯离子协同转运子(kcc)基因表达的调节作用。方法2006年1月至8月于中国医科大学盛京医院院中心实验室,采用酶联免疫吸附实验法确定不同时间点IGF-2细胞增殖曲线,采用聚合酶链反应法比较不同浓度、不同时间IGF-2作用下kcc1、kcc3、kcc4 mRNA表达水平的差异。结果低浓度的IGF-2刺激Caski细胞增殖的同时抑制细胞表面kcc基因的表达,kcc1、kcc3、kcc4 mRNA分别下降30%、50%和80%,随着IGF-2浓度的升高,对kcc基因的作用逐渐减弱。结论IGF-2对Caski细胞表面的kcc基因表达存在影响,这种刺激作用呈时间和浓度依赖性。为进一步研究IGF2通过kcc参与子宫颈细胞恶变过程提供了实验依据。

基于脑脊液冲刷规律探讨枣仁安神颗粒对大鼠睡眠作用机制研究

[目的]基于脑脊液分泌和冲刷作用规律探讨枣仁安神颗粒改善正常大鼠睡眠状态的作用机制。[方法]选取雄性SD大鼠44只,随机分为正常组和枣仁安神颗粒组,每组22只。连续8 d对枣仁安神颗粒组大鼠灌服枣仁安神颗粒水溶液,正常组以等量纯净水灌服作为对照。分析大鼠给药第6至8天脑电(EEG)、肌电(EMG)特征,觉醒期、非快眼动睡眠期(NREM)、快眼动睡眠期(REM)时长,给药8 d后,超高场强核磁共振成像设备检测大鼠中脑导水管中段处脑脊液平均流速,酶联免疫吸附(ELISA)法测定大鼠大脑前额叶皮质水通道蛋白1(AQP1)和钠离子(Na^(+))-钾离子(K^(+))-氯离子(Cl-)协同转运蛋白1(NKCC1)含量,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测大脑前额叶皮质AQP1、NKCC1蛋白表达(因EEG植入手术含金属,无法进行核磁共振监测,故每组用于EEG描述的有8只大鼠,核磁共振监测的有6只大鼠,检测蛋白表达情况的有8只大鼠)。[结果]与正常组相比,枣仁安神颗粒组觉醒期时间缩短(P<0.01),睡眠时间增加(P<0.01),NREM、REM时间增加(P<0.01),枣仁安神颗粒组第6、7、8天之间的觉醒时间逐日减少(P<0.01),睡眠时间逐日增加(P<0.01),NREM、REM时间增加(P<0.01),对大鼠24 h睡眠结构产生影响(P<0.01),中脑导水管中段处脑脊液平均流速加快(P<0.05),大脑前额叶皮质AQP1、NKCC1含量增加(P<0.05),大脑前额叶皮质AQP1、NKCC1蛋白表达升高(P<0.05)。[结论]枣仁安神颗粒可以显著缩短正常大鼠觉醒期,延长睡眠期,特别是NREM与REM,其机制可能与增加脑脊液分泌蛋白AQP1、NKCC1的蛋白表达从而促进脑脊液冲刷有关。

阳离子-氯离子协同转运体在癫痫发病机制研究及抗癫痫药物研发中的进展

研究证明在大鼠及人类正常的脑发育过程中Na^+-K^+-2Cl^-协同转运体1(NKCC1)、K^+-Cl^-协同转运体2(KCC2)表达模式明显不同。研究它们不同表达模式对γ-氨基丁酸(GABA)作用的影响不仅有助于深入理解癫痫的致痫机制,还可为新型抗癫痫药物的研发提供理论基础。本文就NKCC1及KCC2研究的历史、进展及在癫痫致痫机制中的研究现状做一简要综述。

氯离子协同转运蛋白KCC2和NKCC1在正常成年大鼠背根神经节内的表达

【目的】观察氯离子协同转运蛋白钾离子氯离子共转运体2(potassium-chloride cotransporter-2,KCC2),钠离子钾离子氯共转运体1(sodium potassium chloride cotransporter,NKCC1)在正常成年大鼠背根神经节内的表达。【方法】成年SD大鼠,用4%多聚甲醛固定,取背根神经节,神经肽能物质SP和钠通道蛋白Nav的免疫组织化学用来鉴定背根神经节,KCC2和NKCC1在背根神经节内的免疫组织化学,普通显微镜观察结果拍照。【结果】KCC2在背根神经节内没有表达,NKCC1在背根神经节神经元胞浆有表达。【结论】KCC2在大鼠背根神经节没有表达和NKCC1在背根神经节有表达提示背根神经节内神经元氯离子稳态系统不同于其它神经系统部位,这也可能是背根神经节内神经元对GABA表现为去极化的原因。

钾-氯离子协同转运体2参与痛觉敏化形成的研究进展

背景痛觉敏化的机制尚未清楚，以往研究集中在神经系统兴奋性增强，近年来抑制性功能下调在痛觉敏化中的作用引起关注。中枢神经系统抑制性受体^y氧基丁酸A（γ-aminobutyricacidA，GABA。）受体的标志性蛋白之一钾-氯离子协同转运体2（K＋-Cl-cotransporter2，KCC2）在神经元从抑制到兴奋的转变中起了重要作用。KCC2通过影响Cl-的浓度来影响吖一氨基丁酸／甘氨酸所介导的抑制作用，进而影响神经系统兴奋性。目的就KCC2在痛觉敏化发生过程中的作用及相关通路进行综述。内容多种细胞外信号可以激活小胶质细胞并且引起P2X4Rs的上调；P2X4Rs的激活触发脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）从小胶质细胞的释放；BDNF到神经元的酪氨酸蛋白激酶B受体（tyrosine kinase Breceptor，TrkB）信号通路改变KCC2的功能，导致神经元Cl-外排能力的降低，从而抑制1弓瓦基丁酸／甘氨酸所介导的抑制作用。趋向研究KCC2参与痛觉敏化形成的机制，为痛觉过敏化的治疗提供新的靶点。

脊髓水平钾氯离子协同转运体2在尼古丁戒断大鼠痛觉过敏中的表达

目的观察尼古丁戒断后大鼠痛觉过敏中脊髓水平钾氯离子协同转运体2（K＋-Cl-cotransporter2，KCC2）的表达。方法健康雄性sD大鼠60只，体重180g～250g，采用随机数字表法分为3组：正常对照组（C组，12只）、生理盐水组（NS组，12只）、尼古丁戒断组（NT组，36只）。C组不注射，Ns组和NT组分别皮下注射生理盐水、尼古丁3mg／kg，3次，d，连续7d，末次注射后60min皮下注射美加明1mg／kg。观察大鼠尼古丁戒断后热缩足反射阈值（thermalwithdrawallatency，TWL）的变化及脊髓KCC2表达水平。采用免疫荧光法检测大鼠脊髓KCC2的分布，Westernblot法检测KCC2蛋白的表达变化。结果NS组TwL与C组比较差异无统计学意义（P〉0．05）；与c组比较，NT组TwL在尼古丁戒断后1d-7d显著缩短（P〈0．01），且在尼古丁戒断后第4天降为最低[（16．2±0．6）s比（8．4±0．3）s]（P〈0．01）。C组和Ns组脊髓水平KCC2表达相对值比较差异无统计学意义（P〉0．05）；NT组脊髓背角浅层的KCC2表达相对值较C组显著减少[（1．042±0．022）比（0．231±0．013）]（P〈0．01）。结论尼古丁戒断后大鼠痛觉过敏形成中脊髓背角浅层的KCC2表达降低。

呋噻米对辣椒素介导的胞外信号调节激酶磷酸化的抑制作用

目的:观察阳离子-氯离子联合转运蛋白(CCC)阻断剂在辣椒素介导的胞外信号调节激酶(ERK)活化中的作用。方法:成年大鼠脊髓700μm厚切片,分成空白对照组、辣椒素组、呋噻米组、辣椒素+呋噻米组,予以相应药物处理后固定,再行冰冻切片,进行荧光免疫组化检测程序。对脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层的磷酸化的细胞外信号传导激酶阳性(pERK IR)细胞计数,行统计学处理。结果:对照组、辣椒素组、呋噻米组、呋噻米+辣椒素组pERK阳性细胞数分别为4.19±0.42;26.83±1.14;12.31±0.90;12.14±0.72(P<0.001)。呋噻米+辣椒素组阳性细胞数比辣椒素组减少(P<0.001)。结论:呋噻米可抑制辣椒素介导的胞外信号调节激酶磷酸化,具抗伤害作用。