氯膦酸二钠脂质体不同给药剂量和方式对骨髓巨噬细胞清除效果的研究

目的 研究氯膦酸二钠脂质体不同给药剂量和方式对骨髓巨噬细胞的清除效果。方法 用雄性BALB/c和C57BL/6小鼠复制异基因造血干细胞移植(HSCT)模型,随机分为HSCT组、HSCT+ip100组(HSCT+氯膦酸二钠脂质体腹腔注射100μL)、HSCT+iv100组(HSCT+氯膦酸二钠脂质体静脉注射100μL)、HSCT+iv150组(HSCT+氯膦酸二钠脂质体静脉注射150μL)、HSCT+iv200组(HSCT+氯膦酸二钠脂质体静脉注射200μL)、HSCT+iv250组(HSCT+氯膦酸二钠脂质体静脉注射250μL)。HSCT后第1天注射氯膦酸二钠脂质体,之后每5天注射1次,直至相应时间点获取样本。采用流式细胞术和Western blotting检测骨髓巨噬细胞数量的变化,依据全血细胞计数确定外周血的变化,HE染色观察骨髓腔损伤。结果 与HSCT组比较,其余各组小鼠的外周血白细胞计数明显增加(P <0.05)。与氯膦酸二钠脂质体腹腔注射相比,静脉注射骨髓巨噬细胞清除效果明显(P <0.05)。流式细胞术结果显示,氯膦酸二钠脂质体静脉注射清除效果随着脂质体剂量的增加而更加明显。HE染色结果显示,随着氯膦酸二钠脂质体剂量的增加,骨髓腔中的脂肪空泡越来越多。结论氯膦酸二钠脂质体静脉注射清除骨髓巨噬细胞优于腹腔注射,在一定剂量内,骨髓巨噬细胞随着氯膦酸二钠脂质体注射剂量的增加,清除效果越明显。

氯膦酸二钠脂质体对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

目的:探讨氯膦酸二钠脂质体(liposomal clodronate,LC)的制备及对大鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages,PM)功能的影响.方法:利用薄膜法制备LC;分离培养大鼠PM,用不同浓度的LC(50,100,150μmol/L)分别作用于大鼠PM,然后采用MTT比色法,中性红比色法,检测NO,O2-和H2O2的含量来评估巨噬细胞功能.结果:在三种不同浓度LC的干预下,MTT结果显示巨噬细胞的生长受到明显抑制(P<0.01);巨噬细胞吞噬中性红结果表明其吞噬功能受到明显抑制,抑制率分别为17.4%,25.8%和38.0%;巨噬细胞分泌NO、O2-的能力也受到明显抑制,与对照组相比差异具有显著性(48.398±0.667,27.664±0.566,25.626±0.184vs91.714±1.726;0.289±0.017,0.256±0.013,0.216±0.003vs0.342±0.022,均P<0.05);巨噬细胞产生H2O2的能力仅在100μmol/L与150μmol/L时受到明显抑制(0.261±0.002,0.213±0.015vs0.277±0.003,均P<0.05).结论:LC对大鼠PM功能具有抑制作用.

氯膦酸二钠脂质体对重症急性胰腺炎大鼠脑损伤的保护作用

目的:探讨氯膦酸二钠脂质体对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠脑损伤的保护作用。方法:利用薄膜法制备氯膦酸二钠脂质体。将48只健康雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组、空白脂质体组(LB组)和氯膦酸二钠脂质体组(LC组)。LB组和LC组采用胰腺被膜下均匀注射5%牛磺胆酸钠(2 m L/kg)制备SAP模型,假手术组仅模拟注射操作。LB组在建模后立即于大鼠尾静脉内注射空白脂质体(4 m L/kg),LC组注射氯膦酸二钠脂质体(4 m L/kg)。制模后2 h、6 h取肠系膜上静脉血液,检测各组大鼠血清中淀粉酶、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量;观察各组胰腺组织的病理学变化及胰腺病理学评分;检测脑组织的含水量、伊文氏蓝浓度和脑脊液中髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)含量。结果:LB组较假手术组2 h、6 h血清淀粉酶、IL-6、TNF-α含量及胰腺病理学评分均显著增高(P<0.01),LC组较LB组2 h、6 h血清淀粉酶、IL-6、TNF-α含量及胰腺病理学评分均显著降低(P<0.01);LB组较假手术组2 h、6 h脑组织的含水量、伊文氏蓝浓度及脑脊液MBP含量均显著增高(P<0.01),LC组较LB组2 h、6 h脑组织的含水量、伊文氏蓝浓度及脑脊液MBP含量均显著降低(P<0.01)。结论:氯膦酸二钠脂质体可选择性清除单核-巨噬细胞,对SAP大鼠脑组织损伤有保护作用。

氯膦酸二钠脂质体对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜Akt、MAPK(ERK1/2)活性的影响

目的:研究氯膦酸二钠脂质体(liposomal clodronate,LC)对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠肠黏膜蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和丝裂原活化蛋白激酶1/2[mitogen-activated protein kinase,MAPK(ERK1/2)]活性的影响,探讨LC治疗SAP肠黏膜损伤的保护作用.方法:利用薄膜法制备LC.SD大鼠48只,随机分为3组:对照组(C组)、SAP+空白脂质体治疗组(P组)、SAP+Clodronate脂质体治疗组(T组).P组和T组采用胰腺被膜下均匀注射5%牛磺胆酸钠制作SAP模型后,分别经尾静脉注射空白脂质体和Clodronate脂质体,C组仅注射等量生理盐水.制模后2、6 h分别取肠系膜上静脉血液,检测各组大鼠血清中淀粉酶(amylase,AMS)的含量,同时检测各组大鼠血清中白介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量,观察各组肠黏膜的病理学变化及病理评分,采用免疫组织化学方法检测肠黏膜巨噬细胞Akt和MAPK(ERK1/2)的表达情况.结果:P组大鼠在制模后2、6 h的血清AMS水平较C组明显升高(P<0.01).与P组比较,T大鼠各时相的血清AMS水平均显著降低(P<0.01).P组较C组2、6 h血清IL-6和TNF-α明显升高(P<0.01).T组各时相较P组血清IL-6和TNF-α显著降低(P<0.01).T组大鼠的肠黏膜病理变化均较P组明显减轻,病理学评分明显降低(P<0.01).T组肠黏膜Akt和MAPK(ERK1/2)的表达较P组明显减少.结论:巨噬细胞在SAP大鼠肠黏膜损伤中起重要作用,LC可选择性清除巨噬细胞,减少肠黏膜Akt、MAPK(ERK1/2)的表达,对肠黏膜损伤有一定的保护作用.

氯膦酸二钠脂质体对重症急性胰腺炎大鼠胰腺损伤的影响

目的:探讨氯膦酸二钠脂质体(liposomal clodronate)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺损伤的保护作用。方法:利用薄膜法制备氯膦酸二钠脂质体。采用胰腺被膜下均匀注射5%牛磺胆酸钠制作SAP模型。SD大鼠48只,随机分为对照组(C组)、空白脂质体组(P组)、氯膦酸二钠脂质体组(T组)。P组和T组大鼠制作SAP模型。制模2h和6h后取肠系膜上静脉血液,检测各组大鼠血清中淀粉酶、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,观察各组胰腺组织的病理学变化及胰腺病理评分,免疫组化检测胰腺Caspase-3的表达。结果:P组大鼠的血清淀粉酚水平较C组明显升高(P<0.01),T组大鼠的血清淀粉酶水平显著低于P组。P组较C组2、6h血清IL-6、TNF-α明显升高(P<0.01),T组较P组大鼠的2、6h血清IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.01)。T组大鼠的胰腺病理变化较P组明显减轻,胰腺组织病理学评分明显降低(P<0.01)。胰腺Caspase-3阳性表达增多。结论:氯膦酸二钠脂质体可选择性清除单核/巨噬细胞,对SAP大鼠胰腺损伤有保护作用。

氯膦酸二钠脂质体清除肝内巨噬细胞对CCl4诱导的慢性肝损伤大鼠门脉高压的影响

目的观察氯膦酸二钠脂质体清除肝内巨噬细胞对CCl 4诱导的慢性肝损伤大鼠门脉高压的影响。方法随机将48只Wistar大鼠分为对照组和模型组,每组24只。采用皮下注射橄榄油和四氯化碳(CCl 4)法制备肝损伤模型。在实验d 70,再将每组分为2个亚组,分别经尾静脉注射磷酸盐缓冲液脂质体(PL)或氯膦酸二钠脂质体(CL)处理。在实验d 105,使用BL-420F生理机能实验系统测定大鼠肝脏在体门静脉压力,采用ELISA法检测血sCD163水平,采用免疫组化法检测肝组织CD163和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达。结果在对照组内,CL处理大鼠血清sCD163水平为(798.6±61.9)pg/L,显著低于PL处理组[(848.3±26.2)pg/L,P<0.05];在模型组内,CL处理大鼠肝脏指数和门静脉压力分别为(4.7±0.8)和(10.6±2.0)mmHg,显著低于PL处理组[分别为(5.6±1.3)和(12.4±2.7)mmHg,P<0.05];模型组CL处理大鼠血清ALT、AST和sCD163水平分别为(69.9±21.4)U/L、(202.8±14.2)U/L和(980.1±122.3)pg/L,与PL处理大鼠比,均有显著性差异[分别为(97.8±39.6)U/L、(290.6±168.1)U/L和(1083.2±97.2)pg/L,P<0.05];免疫组化结果显示,CL处理大鼠肝组织CD163和iNOS蛋白阳性表达较PL处理大鼠有不同程度的减弱。结论巨噬细胞参与门脉高压的发生和发展。清除巨噬细胞可降低门静脉压力。

氯膦酸二钠脂质体对重症急性胰腺炎大鼠心肌损伤的保护作用

目的:探讨氯膦酸二钠脂质体(clodronate liposome,LC)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠心肌损伤的保护作用。方法:将48只SD大鼠随机分为假手术组、SAP组及SAP+LC组,各组再分为术后2 h和6 h组(n=8)。测定大鼠血清IL-6、淀粉酶及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量,HE染色观察LC对SAP大鼠心肌组织病理损伤的影响,普鲁士蓝染色法观察LC对SAP大鼠心肌细胞间巨噬细胞的影响,免疫组化法观察LC作用后SAP大鼠丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的表达。结果:假手术组术后2、6 h血清IL-6、淀粉酶、TNF-α含量均分别明显低于SAP组和SAP+LC治疗组(P<0.05),SAP+LC组明显低于SAP组(P<0.05)。假手术组术后2、6 h心肌组织病理学评分明显低于SAP组和SAP+LC组(P<0.05),SAP+LC组明显低于SAP组(P<0.05)。假手术组术后2、6 h心肌细胞间巨噬细胞数量明显低于SAP组和SAP+LC组,SAP+LC组明显低于SAP组。假手术组术后2、6 h心肌组织MAPK评分明显低于SAP组和SAP+LC组(P<0.05),SAP+LC组明显低于SAP组(P<0.05)。结论:LC可选择性清除单核/巨噬细胞,对SAP大鼠心肌损伤起到保护作用。

氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞对小鼠造血干祖细胞归巢过程的影响

目的探讨清除巨噬细胞对小鼠造血干祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSPC)归巢过程的影响。方法免疫磁珠分选获得小鼠HSPC,使用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimide ester,CSFE)染色标记,采用氯膦酸二钠脂质体(clodronate liposomes,Clod)方法建立去除巨噬细胞的小鼠模型,通过流式细胞术检测HSPC移植的归巢效率,通过实时荧光定量逆转录酶链式反应方法和酶联免疫吸附测定方法检测去除巨噬细胞后骨髓微环境中CXCL12、SCF和人血管内皮细胞粘附分子1(vascular adhesion molecule 1,VCAM1)分子mRNA表达水平和蛋白表达水平的变化。结果氯膦酸二钠脂质体作用后第24小时和第48小时,小鼠骨髓中CD11b+F4/80+巨噬细胞数量显著减少(P<0.05);移植小鼠HSPC后,相较于对照组,去除巨噬细胞组小鼠HSPC归巢效率显著降低(P<0.05);同时去除巨噬细胞组小鼠骨髓微环境中CXCL12、SCF的mRNA和蛋白表达量比对照组显著降低(P<0.05),而VCAM1表达量无显著变化。结论去除巨噬细胞能够显著降低小鼠HSPC归巢效率,该作用可能与去除巨噬细胞后导致的骨髓微环境中CXCL12与SCF含量减少有关。

氯膦酸二钠脂质体治疗小鼠膝骨关节炎的作用机制

目的探讨氯膦酸二钠脂质体对于小鼠膝骨关节炎(KOA)的治疗作用.方法将30只健康小鼠随机均分为对照组、空白组、治疗组,每组各10只,4、8周时在各组提取5个膝关节标本,采用PCR技术检测白细胞介素-6(IL-6)与基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的基因表达水平.结果4、8周时,空白组与治疗组IL-6及MMP-13表达水平,均明显低于对照组(P<0.05),治疗组与空白组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),4周治疗组与8周治疗组IL-6及MMP-13表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论氯膦酸二钠脂质体能有效降低KOA小鼠关节液中的IL-6、MMP-13表达水平.

氯膦酸二钠脂质体对胰腺炎肾损伤的保护作用

目的 探讨氯膦酸二钠脂质体（liposomal clodronate）对大鼠重症急性胰腺炎肾损伤的干预效应。方法SD大鼠48只，随机分为三组：对照组（C）、SAP＋空白脂质体组（P）、SAP＋Clodronate-脂质体治疗组（T）。经大鼠胰腺被膜下均匀注射5％牛磺胆酸钠制备SAP模型，C组仅胰腺被膜下注射等量生理盐水，P组经尾静脉注射空白脂质体，T组经尾静脉注射Clodronate-脂质体。在制模后2，6h取血，测定血清AMS，BUN，Cr，IL-6及IL-12，观察肾脏和胰腺组织的病理学变化。结果与C组比较，P组2，6h胰腺及肾病理改变明显加重。P组各时相BUN，Cr较C组明显增高（P〈0．01），IL-6，IL-12在2，6h明显增加（P〈0．01）。与P组比较，T组在制模后2，6h胰腺及肾的病理损害较P组有所减轻，T组各时相血浆Cr较P组明显降低（P〈0．01），BUN6h降低有显著意义（P〈0．05），IL-6，IL-12在2，6h明显降低（P〈0．01）。结论炎症介质的过度释放在SAP肾组织损伤中起着重要的作用，Clodronate经脂质体包裹对胰腺及肾损害具有保护作用。

两种方法清除大鼠子宫内膜巨噬细胞的比较研究

目的通过比较氯膦酸二钠脂质体不同给药途径的作用差异,探索更有效的大鼠子宫内膜巨噬细胞清除方法。方法雌性8周龄SD大鼠随机分为单侧对照组(左侧宫腔注射磷酸缓冲盐脂质体100μL)、单侧清除组(右侧宫腔注射氯膦酸二钠脂质体100μL)、双侧对照组(双侧宫腔注射磷酸缓冲盐脂质体100μL)、双侧清除组(双侧宫腔注射氯膦酸二钠脂质体100μL)、全身对照组(尾静脉注射磷酸缓冲盐脂质体500μL)和全身清除组(尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体500μL)。注射后48 h,获取组织样本。采用HE染色观察子宫、卵巢组织形态结构,免疫组化观察子宫、卵巢组织中巨噬细胞阳性表达,流式细胞术检测子宫、卵巢组织中巨噬细胞数量的变化。结果各组大鼠子宫、卵巢组织结构与形态并无明显差异。免疫组化法结果显示,与对照组相比,单侧及双侧清除组中子宫巨噬细胞阳性表达明显降低(P<0.001),卵巢巨噬细胞阳性表达无影响(P>0.05),全身清除组子宫和卵巢组织中巨噬细胞阳性表达均减少(P<0.01,P<0.01);与单侧及双侧清除组相比,全身清除对卵巢组织中巨噬细胞阳性表达的影响更大(P<0.05)。流式细胞术检测显示,与对照组相比,各清除组均能有效降低子宫组织中巨噬细胞百分比(P<0.001,P<0.001,P<0.05),与全身清除组相比,单侧及双侧清除组子宫内膜巨噬细胞清除效果更好(P<0.05,P<0.05);各清除组卵巢组织中巨噬细胞数量与对照组相比均有所下降,其中全身清除组巨噬细胞数目减少最明显(P<0.05),单侧及双侧清除组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论局部宫腔注射氯膦酸二钠脂质体清除子宫巨噬细胞的方式优于尾静脉注射,并可避免其对卵巢巨噬细胞的影响,是建立理想的子宫局部巨噬细胞清除模型的最佳方法。

膦酸盐通过消耗巨噬细胞抑制非酒精性脂肪性肝炎的脂肪变和小叶炎症

目的探讨非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中巨噬细胞的作用,为代谢性肝病的治疗靶点提供方向。方法将20只6-8周C57BL/6野生型雄性小鼠随机分为两组:对照组5只,蛋氨酸胆碱缺乏饮食(MCD);实验组15只,MCD饮食+腹腔注射氯麟酸二钠脂质体(以清除巨噬细胞)。喂养4周建立小鼠NASH模型,留取血、肝脏及脾脏,分析体质量指数、肝指数、脾指数及检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平;通过HE染色及油红O染色进行非酒精性脂肪性肝病活动度评分(NAS);用RT-PCR方法比较F4/80 mRNA的相对表达水平。组间数据比较采用t检验进行分析。结果MCD喂养小鼠4周建立NASH模型,实验组F4/80的mRNA表达量下降(t=4.167,P<0.01),肝脂肪变性减轻(t=10.70,P<0.05),小叶炎症浸润程度减轻(t=3.08,P<0.05),NAS评分降低(t=8.06,P<0.05)。同时,ALT水平明显下降[(817.00±128.90)U/L与(231.20±36.28)U/L,t=5.71,P<0.01],AST水平也降低[(1211.00±248.90)U/L与(505.30±88.20)U/L,t=3.32,P<0.01];但实验组脾脏体积及脾指数较大(0.24±0.01与0.32±0.02,t=2.41,P<0.05);肝脏气球样变、体质量指数及肝指数在两组的差异无统计学意义。结论在NASH中,麟酸盐可消耗巨噬细胞而发挥抑制肝脏炎症及保护受损肝脏的作用。

子宫内膜巨噬细胞通过调控血管内皮生长因子A的表达影响胚胎着床

目的研究小鼠子宫内膜巨噬细胞(macrophages,Mφ)对血管内皮生长因子A(VEGFA)表达的影响,探讨其在胚胎着床过程中的作用。方法取第3.5(雌鼠交配后次日晨阴道见栓为第0.5)孕鼠30只,随机分为3组,实验组(E)、对照组(C)和空白组(B)。E组向左侧宫腔内注射消除巨噬细胞的药物:氯膦酸二钠脂质体(clodronate liposomes,CL),右侧注射磷酸缓冲盐脂质体(PBS liposomes,PL);C组向双侧宫腔内注射PL;B组向双侧宫腔内注射等体积灭菌PBS溶液。注射后48 h,获取第5.5小鼠子宫和卵巢,统计各单侧子宫的胚胎着床数。采用免疫组化技术检测子宫内膜、卵巢内Mφ数量,并观察着床位点和非着床位点VEGFA的表达变化。流式细胞学方法检测子宫F4/80+CD11b+Mφ相对百分比,观察注射CL对子宫Mφ的选择性抑制作用。结果流式细胞学和免疫组织化学方法均显示,E组左侧子宫注射氯膦酸二钠脂质体后,与E组右侧和C、B组比较,局部巨噬细胞被显著抑制(P<0.05),抑制率达74%。各组卵巢Mφ数量间则未见明显差异。E组左侧子宫的胚胎着床部位宫腔未闭合,平均胚胎着床数为2.20±1.81个,显著低于E组右侧5.10±1.91个(P<0.05)。在着床位点,伴随子宫Mφ受到抑制,子宫内膜的VEGFA蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论子宫内膜中的Mφ为胚胎着床所必需,其机制可能是通过调控VEGFA的表达,影响宫内膜容受性及胚胎着床。

清除巨噬细胞加重葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎

目的观察小鼠腹腔注射氯膦酸二钠脂质体(Clodrolip)后对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)的影响。方法将小鼠分为两组(DSS、DSS+Clodrolip组)后均予以3%DSS饮用水饲养7 d,DSS+Clodrolip组于造模前3 d、造模当天及造模第2、4、6天腹腔注射200μL的Clodrolip。观察体质量变化率、疾病活动指数(DAI)评分、结直肠长度、脾脏质量及组织学损伤,实时荧光定量PCR(RT-PCR)判断巨噬细胞清除情况及肠道组织炎性因子表达情况,TUNEL法检测肠上皮细胞凋亡情况。结果DSS+Clodrolip组小鼠肠组织、肝脏组织内F4/80相对表达水平较DSS组均明显降低。从造模第4天开始,DSS+Clodrolip组小鼠体质量变化率较DSS组明显下降;造模第1天DSS+Clodrolip组小鼠率先出现DAI评分,从造模第4天开始,DSS+Clodrolip组小鼠DAI评分较DSS组明显升高。DSS+Clodrolip组小鼠结直肠长度较DSS组缩短;DSS+Clodrolip组小鼠脾脏质量较DSS组增加。DSS+Clodrolip组小鼠的白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)相对表达水平高于DSS组。DSS+Clodrolip组小鼠肠上皮细胞凋亡情况较DSS组明显。结论Clodrolip能够上调促炎因子的表达,促进肠上皮细胞的凋亡,加重DSS诱导的小鼠UC。