杆状病毒载体介导的氯霉素乙酰转移酶基因在HepG2中的表达

目的 重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达。方法 用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因及CMV与核因子（NFκB）启动子和增强子序列，并插入AcMNPV中，用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒。分别感染昆虫细胞Sf5和人肝癌细胞株HepG2或HepG2.2.15细胞，测定CAT表达相对活性。结果 由CMV启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2或HepG2.2.15细胞均可表达CAT，而NFκB启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2细胞中CAT表达低，而在有HBV表达的HepG2.2.15细胞中有较高的CAT表达活性。结论 重组杆状病毒能在人肝癌细胞中表达外源基因，而且成功构建了HBV感染细胞特异性表达的杆状病毒载体。

杜氏盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子驱动氯霉素乙酰转移酶基因的表达及其活性检测

目的为建立稳定高效的盐藻生物反应器寻找合适的内源性启动子驱动表达外源基因。方法克隆鉴定了盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因5'上游区序列并成功构建由盐藻GAPDH基因启动子驱动的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因表达载体pUC-Gcat。利用构建的表达载体电击转化盐藻并在含有氯霉素的培养基中筛选转化藻株。随机挑选稳定转化的盐藻藻株进行CAT酶联免疫吸附测定分析。结果获得3株稳定转化的盐藻藻株。聚合酶链式反应鉴定和CAT酶联免疫吸附测定分析结果表明,CAT基因已整合到了转化的盐藻基因组中。结论本研究所克隆的内源性盐藻GAPDH基因启动子能够驱动CAT基因在盐藻中表达。

氯霉素乙酰基转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立氯霉素乙酰基转移酶 (chloramphenicolacetyltransferase ,CAT)双抗体夹心ELISA的实验室检测方法。方法 从质粒pBLCAT6经PCR扩增CAT基因序列 ,插入到原核表达质粒pGEX 2T中 ,在大肠埃希菌DH5α中诱导表达 ;以纯化的融合蛋白GST CAT为抗原免疫实验用兔 ,得到的CAT抗血清进行生物素标记 ,并在此基础上利用生物素链和亲和素放大系统建立双抗体夹心ELISA法。构建不同YY1结合位点突变的HPV16LCRCAT报道质粒 ,体外瞬时转染真核细胞 ,提取胞质蛋白 ,以建立的方法进行CAT表达检测。结果 SDS PAGE显示表达的GST CAT融合蛋白相对分子质量约为 5 40 0 0 ;制备的CAT抗血清可有效地识别原核及哺乳动物细胞表达的CAT蛋白 ;在不同启动子及调节序列的控制下 ,利用建立的CAT检测技术证明在瞬时转染的细胞中可诱导 2～ 8倍的CAT表达增强。结论 建立的双抗体夹心ELISA方法可敏感地反映上游序列的启动子活性 ,以及启动子调节序列变化对启动子活性的影响 。

CAT为报告基因的铜绿假单胞菌启动子文库的建立及初步鉴定

以CAT（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）为报告基因,构建p CAT2启动子探针载体从绿脓杆菌基因文库中筛选启动子。Sau3AⅠ酶切铜绿假单胞菌的基因组,回收（500-1 500 bp）片段并与p CAT2载体连接构建铜绿假单胞菌的基因组文库,PCR鉴定文库的多样性,利用氯霉素（10μg/m L）和卡那霉素（50μg/m L）双抗平板筛选了16株阳性菌株,并用PCR、测序、NCBI比对进行鉴定。构建的基因文库的库容量可达50 000个,覆盖基因全长的3.5倍,插入率达90%,具有较强的随机性。采用双抗平板进行启动子的筛选,筛选效率高达96%。获得了绿脓杆菌基因组中的9个启动子,同源性达99%以上,并对其活性进行初步鉴定,为铜绿假单胞菌基因表达调控的进一步研究奠定基础。

2型糖尿病患者醛糖还原酶基因5′调控区的多态性与功能

为了探讨醛糖还原酶基因 5′调控区存在的可引起蛋白质表达发生改变的遗传变异及这些变异与糖尿病视网膜病变的相关性 ,应用PCR SSCP分析对醛糖还原酶基因 5′调控区 - 60 9～ + 4 0的DNA片段进行了筛选 .所有变异体均进行DNA序列分析并克隆至氯霉素乙酰转移酶报告基因载体(pCATreportervector) ,然后将重组质粒转染HeLa细胞 ,通过检测氯霉素乙酰转移酶的活性求出启动子的相对活性 .同时进行凝胶滞留试验与足纹分析以确定DNA与核蛋白的相互作用 .结果显示 ,在 1 45名 2型糖尿病患者及 1 2 3名正常对照的醛糖还原酶基因 5′调控区除野生型外 ,共发现 2种多态性 [C( - 1 0 6)T、C( - 1 2 )G].在正常对照与患者中 ,基因型WT WT ,WT C( - 1 2 )G和WT C( - 1 0 6)T的发生率无显著性差异 .在有视网膜并发症与无视网膜并发症的 2型糖尿病患者中 ,WT C( -1 0 6)T的发生率分别为 35 5%和 1 7 9% ( χ2 =4 0 0 ,P <0 0 5) ,WT C( - 1 2 )G的发生率分别为1 5 5%和 3 3% ( χ2 =3 43,P >0 0 5) .在有并发症的患者中 ,WT C( - 1 2 )G和WT C( - 1 0 6)T两者的总发生率为 42 3% ,显著高于无并发症的患者 ( 2 0 0 % ) ( χ2 =6 2 3,P <0 0 2 5) .野生型 ,C( - 1 2 )G和C( - 1 0 6)T等

JAB1、LPS对糖皮质激素受体转录激活活性的影响

目的 体外观察JAB1基因转染对糖皮质激素受体转录活性的调控作用。方法 采用体外培养COS 7细胞 ,脂质体法共转染含全长人JAB1基因质粒pCDNA3.1 JAB1、pCMV hGRα及含CAT报告基因质粒pMAMneo CAT ,设置不同剂量梯度的pCDNA3.1 JAB1质粒 ,转染 36h后用ELISA方法检测氯霉素乙酰转移酶 (CAT)活性来观察JAB1基因转染对GR转录激活活性的影响。结果 随着pCDNA3.1 JAB1质粒剂量的增加 ,CAT浓度也逐渐上升 ,表明GR的转录激活活性也逐渐增加。LPS能显著地降低CAT浓度 ,但共转染 pCDNA3.1 JAB1质粒可反转CAT活性的降低。结论 JAB1能增强GR的转录激活活性 ,LPS能抑制GR的转录激活能力。

小反刍兽疫病毒原核表达体外转录系统的建立

构建了小反刍兽疫病毒(PPRV)辅助质粒和微型复制子(minireplicon)并进行功能学研究。RT-PCR克隆PPRV疫苗株N75/1N、P和L基因,亚克隆至有T7启动子的原核表达载体pGEM3Z构建完成3个辅助质粒,分别命名为pGEM3Z-N、pGEM3Z-P和pGEM3Z-L,并通过全基因合成构建含PPRV病毒5′端启动子序列(AGP)、3′端启动子序列(GP)、T7转录终止信号、丁型肝炎病毒核酶序列HamRZ及氯霉素乙酰转移酶(CAT),获得PPRV微型复制子重组质粒pGEM3Z-CAT。构建完成的微型复制子及辅助质粒在表达T7RNA多聚酶(T7RNP)感染痘病毒VTF7-3后,通过脂质体法优化4种质粒配比,并将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光分析CAT的表达情况,荧光显微镜观察到荧光的表达,并通过免疫印迹分析CAT蛋白的表达,表明构建的PPRV微型复制子具有转录和复制功能,这将有助于进一步开展以PPRV反向遗传操作为基础的免疫学及蛋白功能研究。

痢疾菌体内诱导基因表达文库的构建

目的构建筛选痢疾菌福氏2a体内诱导基因的融合基因表达文库。方法以自杀载体pGP704为骨架,用氯霉素乙酰转移酶基因作为报告基因,构建了用于筛选体内诱导基因的载体pGP-cat。把痢疾菌福氏2a基因组DNA的随机酶切片段0.6-1kb亚克隆到pGPcat载体报告基因上游的BglⅡ位点,构建了融合基因文库。结果与痢疾菌福氏2a2457T结合转移后,获得融合基因表达文库。以氯霉素为选择标记,经过体外初步筛选,得到3.2%的具有氯霉素抗性的菌株。结论构建的融合基因表达文库适用于筛选福氏2a痢疾菌的体内诱导基因。

L-精氨酸增强人凝血因子Ⅷ基因表达机制的研究

目的:进一步探讨L-精氨酸能够增强人凝血因子Ⅷ(hFⅧ)基因在体外的表达机制。方法:扩增B结构域缺失的hFⅧcDNA(BDDhFⅧcDNA)的A1、A2、A3、C1和C2结构域基因,并将其作为启动子,分别插入含氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的载体pCAT3-Enhancer的启动子位点,构建成载体pA1-CAT3-Enhancer、pA2-CAT3-Enhancer、pA3-CAT3-Enhancer、pC1-CAT3-Enhancer和pC2-CAT3-Enhancer。再将各载体分别转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后,加入L-精氨酸(终浓度10mmol/L)培养24h。实验设转染阴性对照(不含启动子)、转染阳性对照,各组再设加L-精氨酸及不加L-精氨酸的对照组(共14组)。采用体外细胞核连缀反应(run-onassay)检测CAT基因的转录,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组HUVECs裂解液中CAT蛋白的含量。结果:在无L-精氨酸存在的情况下,转染阴性对照载体pCAT3-Basic、pA3-CAT3-Enhancer、pC1-CAT3-Enhancer和pC2-CAT3-Enhancer的HUVECs裂解液中均未检测到有CAT基因转录,CAT蛋白含量均为背景值,转染阳性对照载体pCAT3-Control的HUVECs裂解液中CAT基因有强转录,转染pA1-CAT3-Enhancer和pA2-CAT3-Enhancer的HUVECs裂解液中只能检测到微弱的CAT基因转录,CAT蛋白含量分别为(61.85±7.86)pg/106个细胞和(60.27±7.27)pg/106个细胞。在与L-精氨酸共培养24h后,转染pA2-CAT3-Enhancer的HUVECs裂解液中CAT基因的转录和蛋白表达显著增强,CAT蛋白含量达到(368.56±21.85)pg/106个细胞,显著高于未加L-精氨酸组(P<0.01),而转染其他各载体的HUVECs裂解液中CAT基因转录和表达的变化与未加L-精氨酸组间差异均无统计学意义。结论:hFⅧ的A1和A2结构域基因能作为启动子驱动CAT基因的转录和表达,而L-精氨酸可显著增强hFⅧA2结构域基因启动的CAT基因转录和表达。

随机转座子插入构建甲型副伤寒杆菌启动子文库

目的构建携带氯霉素乙酰转移酶(CAT)的转座子自杀性质粒,通过接合转座获得甲型副伤寒沙门氏菌(副甲)启动子文库。方法 PCR扩增CAT的基因亚克隆至pMD-18T载体,鉴定正确后酶切插入转座子自杀性质粒pSC189,获得新的转座子载体pSC-CAT,将携带pSC-CAT的供体菌与副甲受体菌进行接合转座,涂布氯霉素平板筛选转座的细菌,以随机筛选出来的细菌基因组为模板,热不对称PCR扩增插入位点侧翼序列,并进行测序、比对分析。结果筛选获得约1000个突变菌,随机挑取6个菌,转座子插入位点的上游分别对应6个可疑启动子区域。结论通过自杀性转座子载体pSC-CAT可高效获得副甲菌启动子文库,为进一步研究副甲菌基因表达与调控奠定了基础。

大肠杆菌C600染色体DNA中原核增强子样序列的克隆和鉴定

采用大肠杆菌trp启动子,氯霉素乙酰转移酶(CAT)作为标记基因,构建了两个应用氯霉素压力筛选增强子序列的检测载体pKT和pKTP。用pKT,pKTP及pKN2从大肠杆菌C600染色体基因组中克隆到3个原核增强子样序列3A,8A和V6S,这3个片段均具有正、反向增强活性,对β-半乳糖苷酶表达的正向增强活性达到7～8倍,反向增强活性2～3倍。RNA斑点杂交实验证明,3A,8A和V6S片段对于基因表达调控的增强作用均发生在转录水平上。

Construction of a System for the Stable Expression of Foreign Genes in Dunaliella salina

A stable transformation system for the expression of foreign genes in the unicellular greenmarine alga (Dunaliella salina Teod.) was established. Using electroporation, the alga was transformed witha plasmid containing the hepatitis B surface antigen (HBsAg） gene and the chloramphenicol acetyltransferase(CAT) gene as a selectable gene. PCR and Southern blotting analysis indicated that the HBsAEgene wasintegrated into the D. salina genome. Northern dotting analysis showed that the HBsAg gene was expressedat the mRNA level. The stable expression of HBsAg protein in transformants was confirmed by HBsAgenzyme-linked immunosorbent assay (HBsAg EUSA) and Western blotting analysis. Also, PCR and Southernblotting analyses showed that the CA Tgene was integrated into the D, salina genome, and CAT EUSAindicated that CAT protein was stably expressed in the cells. The introduced HBsAg DNA and HBsAgprotein expression were stably maintained for at least 60 generations in media devoid of chloramphenicol.This is the first report of the stable expression of foreign genes in D. salina.

真菌游动孢子遗传转化新系统

原始真菌芸苔油壶菌是一种专性植物寄生菌,可作为天然病毒载体,将烟草坏死病毒(TNV)和某些其它病毒传递到大多数单子叶和双子叶植物根里。美国内布拉斯加州大学和美国农业部农业研究局的L.Zhang及其同事用芸苔油壶菌把外源基因传送到了小麦根里。 他们先将TNV外壳蛋白(病毒粒子)分解,再将其组装到携带氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)的粒子包装质粒里。将产生的核蛋白复合体(假病毒粒子)加到芸苔油壶菌游动孢子溶液里。

临床抗菌药物合理使用问答

问：细菌产生耐药性的机制有哪些？答：细菌产生耐药性的原因很多,主要包括以下几点。（1）产生灭活抗生素的酶：包括β-内酰胺酶（β-lactamase）、氨基糖苷类修饰酶（aminoglycoside modifying enzymes,AME）、氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol

以CAT为报告基因的蜡样芽孢杆菌强组成型启动子的筛选及初步鉴定

目的从蜡样芽孢杆菌基因组中筛选组成型启动子，并对其活性进行鉴定。方法用Sau3AI酶切蜡样芽孢杆菌的基因组，回收片段，连接载体pCMR8a，转化DH5ct感受态后涂布在氯霉素和卡那霉素的培养基上得到强启动子，并对其进行截短和顺反性实验，并检测其启动蛋白表达情况。结果成功筛选到一个具有反向启动外源蛋白表达能力的启动子序列，并能够有效表达多种外源蛋白。结论本实验成功筛选并验证了蜡样芽孢杆菌的一种组成型启动子，能够有效地启动外源蛋白的表达．对实验室中表达某种或某些蛋白和工业生产提供了更多的选择。

中国人2型糖尿病患者醛糖还原酶基因5调控区的多态性与功能

目的 检测AR基因5调控区可能引起启动子功能及蛋白表达的基因改变。 方法 应用PCR-SSCP对AR基因5'调控区进行筛选，所有变异体均进行DNA序列分析并克隆至氯霉素乙酰转移酶报告基因载体（pCAT），然后转染Hela细胞，检测CAT活性求出启动子相对活性。同时进行凝胶滞留试验与足纹分析以确定DNA与蛋白质的相互作用。 结果 在145名2型糖尿病患者及123名正常对照的醛糖还原酶基因5'调控区除野生型外，发现两种多态性C(-106)T 和 C(-12)G。在正常对照和2型糖尿病患者中，基因型WT/WT, WT/C(-12)G 和 WT/C(-106)T的发生率无显著性差异.在有视网膜病变和无视网膜病变的2型糖尿病患者中, WT/C(-106)T 的发生率分别为 31.5%和17.5% (P<0.05), WT/C(-12)G的发生率分别为 10.5%和2.5%（P>0.05）,在有并发症的患者中, WT/C(-12)G 和 WT/C(-106)T的总发生率为41.8%,明显高于无视网膜病变患者的发生率20.0%(P<0.025),野生型, C(-12)G和C(-106)T 的相对转录活性分别为15.7%, 31.0% 和 32.2%,DNA-蛋白质相互作用实验表明,这些变异未改变DNA与反式作用因子的结合位点。 结论 在中国人群中,AR基因5调控区C(-106)T 和 C(-12)G多态与2型糖尿病视网膜病变密切相关。

中国人2型糖尿病患者醛糖还原酶基因5调控区的多态性与功能(英文)

目的 检测AR基因 5调控区可能引起启动子功能及蛋白表达的基因改变。方法 应用PCR SSCP对AR基因 5’调控区进行筛选 ,所有变异体均进行DNA序列分析并克隆至氯霉素乙酰转移酶报告基因载体 (pCAT) ,然后转染Hela细胞 ,检测CAT活性求出启动子相对活性。同时进行凝胶滞留试验与足纹分析以确定DNA与蛋白质的相互作用。结果 在 145名 2型糖尿病患者及 12 3名正常对照的醛糖还原酶基因 5’调控区除野生型外 ,发现两种多态性C( 10 6 )T和C( 12 )G。在正常对照和 2型糖尿病患者中 ,基因型WT/WT ,WT/C( 12 )G和WT/C( 10 6 )T的发生率无显著性差异 在有视网膜病变和无视网膜病变的 2型糖尿病患者中 ,WT/C( 10 6 )T的发生率分别为 31 5 %和17 5 %(P <0 0 5 ) ,WT/C( 12 )G的发生率分别为 10 5 %和 2 5 %(P >0 0 5 ) ,在有并发症的患者中 ,WT/C( 12 )G和WT/C( 10 6 )T的总发生率为 4 1 8%,明显高于无视网膜病变患者的发生率 2 0 0 %(P <0 0 2 5 ) ,野生型 ,C( 12 )G和C( 10 6 )T的相对转录活性分别为 15 7%,31 0 %和 32 2 %,DNA 蛋白质相互作用实验表明 ,这些变异未改变DNA与反式作用因子的结合位点。结论 在中国人群中 ,AR基因 5调控区C( 10 6 )T和C( 12 )G多态与

谷氨酸棒杆菌10147基因组中启动子活性片段的克隆与分析

【目的】获得谷氨酸棒杆菌10147基因组中具有启动子活性片段的结构序列,为构建表达载体做准备。【方法】利用启动子探测载体pAKC6,采用鸟枪法克隆经过限制性内切酶Sau3A I完全酶切的谷氨酸棒杆菌10147染色体DNA片段,并测定pAKC6上报告基因编码的氯霉素乙酰转移酶(CAT)的比活力,以筛选有启动子功能的片段。【结果】共克隆到30个具有启动子功能的片段。其中有3个插入片段启动的氯霉素乙酰转移酶比活力大于24 U/mg,插入片段F57启动的CAT比活力为32.50 U/mg;而插入有启动子Ptrc的阳性对照的CAT比活力为26.33 U/mg。【结论】获得3个DNA插入片段具有与已知启动子Ptrc相当的启动活性,这些片段可以用于构建谷氨酸棒杆菌表达载体。

CK13基因5′旁侧的初步功能分析

目的 探讨细胞角蛋白 13(cytokeratin13,CK13)基因表达调控的机理 ,研究 CK13基因 5′旁侧不同基序对其转录活性的影响。 方法 采用分子克隆结合报告基因分析的方法 ,构建 CK 13基因 5′旁侧 5 13bp内不同基序与氯霉素乙酰转移酶 (chloramphenicol acetyltransferase,CAT)报告基因增强子载体p CAT的重组体 ,通过脂质体介导的转染技术导入 He L a细胞 ,检测各报告基因载体 CAT的相对活性。 结果 CK13基因 5′旁侧起始密码子 ATG上游 - nt.32 5～ - nt.2 0 7间 119bp中具有某种抑制子元件 ,-nt.2 0 6～ - nt.94间 113bp中具有某种增强子元件。 结论 CK13基因 5′旁侧 5 13bp内存在促进及抑制CK13基因表达的反应元件 ,进一步定位这些顺式反应元件并研究与之相互作用的反式作用因子 ,可望阐明 CK13基因表达调控及组织特异性表达的详细机理。

人类XBP1基因5′上游DNA序列的转录激活功能分析(英文)

目的分析人类转录因子X-盒结合蛋白1(X-box binding proteinⅠ,XBP1)基因启动子在不同细胞系中转录活性的差别,研究其转录调控机制。方法在对XBP1基因进行生物信息学分析的基础上,设计6种XBP1启动子缺失突变体,分别包括XBP1基因5′上游-1039~66bp、-859~66bp、-623~66bp、-351~66bp,-227~66bp、-227^-45bp,针对每一种缺失突变体构建相应的氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltansferase,CAT)报告基因载体,再分别瞬时转染K562、HepG2、NIH-3T3和L02细胞,应用报告基因CAT瞬时表达系统,检测XBP1每一种缺失突变体在K562、HepG2、NIH-3T3和L024种不同细胞中的活性差异,并进一步确定XBP1基因启动子的具体调节部位。结果成功获得XBP1基因启动子6种缺失突变体的正确克隆和6种相应的报告基因载体p1-XBP1p,p2-XBP1p,p3-XBP1p,p4-XBP1p,p5-XBP1p,p6-XBP1p,每一种报告基因转染K562、HepG2、NIH-3T3和L024种不同细胞系后,p4-XBP1p和p5-XBP1p在K562、HepG2细胞中的转录活性均高于其它报告载体,p5-XBP1p在HepG2细胞中转录活性最高;而6种报告基因载体在NIH-3T3小鼠成纤维细胞中不具有转录活性。结论XBP1基因的转录激活能力在不同细胞中有所差异,其表达活性具有一定的细胞类型特异性,与细胞类型和细胞状态密切相关;XBP1基因启动子的-227~66bp区域是该启动子的核心部位,而且核心启动子区包括ATG翻译起始密码子的下游部位,这一部位是转录活性的重要部位,一旦缺失,XBP1基因启动子会丧失活性。