带有氯霉素抗性基因标记的重组布氏杆菌S2的构建及其生物学特性

无法区分免疫接种和自然感染是限制布氏杆菌疫苗应用的主要原因。本研究通过基因同源重组技术,用氯霉素抗性基因(Cmr)替代布氏杆菌弱毒S2株的WbkC基因,筛选获得重组布氏杆菌rS2-WbkC株。试验发现,重组菌rS2-WbkC由原先的光滑型转变成粗糙型。rS2-WbkC在TSA培养基上传25代后仍能稳定表达氯霉素抗性蛋白。小鼠动物试验模型表明,rS2-WbkC与S2有相似的保护性,但rS2比S2具有更高的安全性。rS2-WbkC免疫小鼠后,其抗血清可通过平板凝集试验与S2免疫的血清相区分。本研究为布氏杆菌标记疫苗的研制提供了技术平台。

东寨港红树林典型区域氯霉素抗性基因的分布

采用实时荧光定量PCR方法,于2017年8月采集东寨港红树林区域表层沉积物,探究氯霉素抗性基因在该区域的污染情况,同时比较红树区域密林内与密林外沉积物样品中氯霉素抗性基因的分布差异及其与环境因子之间的相关性。结果表明:该区域受氯霉素抗性基因污染严重,基因绝对丰度可高达108 copies·g-1数量级;具有不同耐药机制的氯霉素抗性基因在环境样本中具有不同的组成比例,始终以cml基因居多,证明该地区的氯霉素抗性基因的耐药机制以抗生素主动外排为主;红树林密林内的沉积物样品中氯霉素抗性基因的绝对丰度比其他样点高;氯霉素抗性基因与环境因子的相关性分析显示亚硝酸盐(NO2--N)和氯霉素抗性基因具有极显著相关性。

霍乱弧菌溶原性噬菌体CTXΦ的氯霉素抗性基因标记及诱导

目的 对携带霍乱毒素基因的溶原性噬菌体CTXΦ进行遗传标记 ,以深入研究CTXΦ对霍乱弧菌的转染机制。方法 将CTXΦ基因组中ctxAB的上下游同源序列连接到cat基因的两侧 ,然后通过自杀质粒介导的DNA同源重组技术将霍乱菌株N16 96 1染色体上CTXΦ基因组中的ctxAB基因缺失掉 ,替换以氯霉素抗性基因 ,对CTXΦ基因组进行遗传标记 ,然后用丝裂霉素C诱导这种经抗性基因标记的噬菌体 ,再利用它对古典型霍乱弧菌的转染检测活性。结果 获得了ctxAB缺失、带有cat遗传标记的重组菌株N Φc;诱导出的CTXΦc噬菌体颗粒成功感染了霍乱菌株 1119。结论 N Φc中的CTXΦ带有了氯霉素抗性标记 。

从氯霉素抗性突变株筛选赤霉素高产菌株

应用氯霉素抗性筛选法,将经NTG诱变处理的赤霉素产生菌——水稻恶苗病菌6028菌株(Gibberellafujikuroi6028)原生质体涂布在含有氯霉素2000μg/ml的致死再生培养基平板上,获得了大量氯霉素抗性突变株,其中赤霉素产量高于出发菌的阳性效率达20%,同时获得了在20和60吨罐上产素能力和发酵总亿比出发菌株分别提高7.58%和9.36%的7106高产菌株,且该菌株经连续5次传代试验,产素能力无明显变化。

海参、海胆养殖水体中多抗性细菌抗性基因的初步研究

抗药性细菌对生态环境、养殖业以及人类健康构成严重威胁。以大连海参、海胆养殖场多抗性细菌筛选为基础,采用分子生物学手段对40株抗性细菌进行了氯霉素、土霉素及氟氯霉素抗性基因检测,探讨抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础。

海参、海胆养殖水体中多抗性细菌抗性基因的筛选

由于抗生素药物的大量使用和相当程度的滥用,使得水产病原菌耐药性十分严重,多重药物抗性细菌也时有发生,大大增加了微生物病害防治的难度。为探讨抗性细菌的抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础,本研究以大连海参、海胆养殖水体多抗性细菌筛选为基础,利用分子生物学方法对这些抗性细菌进行了土霉素、氯霉素及氟氯霉素抗性基因的筛选。研究发现,大部分耐药细菌都携带多种抗性基因,证明它们的耐药性都是由相应抗性基因决定的。

双歧杆菌插入失活载体的构建

目的构建双歧杆菌serpin基因插入失活载体,为探究双歧杆菌外膜蛋白Serpin功能做准备。方法在实验室前期构建的p MD18-T/serpin质粒中serpin基因片段的SacⅡ酶切位点插入氯霉素抗性基因cmr,构建双歧杆菌p MD18-T/serpincmr,插入失活载体。结果 PCR成功扩增出了氯霉素抗性基因cmr且测序结果正确;p MD18-T/serpin质粒经SacⅡ单酶切、去磷酸化后与cmr连接,通过菌落PCR、酶切验证和测序显示cmr已成功插入serpin基因片段中。结论成功构建了双歧杆菌serpin基因插入失活载体p MD18-T/serpin-cmr。

打靶载体pIJ792的构建

目的利用pIJ790,pIJ773和pUC19等基本质粒,构建金色链霉菌基因打靶筛选体系所需质粒pIJ792。方法以质粒pIJ790为模板,将PCR扩增的cat基因片段插入到pMD19-T的多克隆位点,得重组质粒pFD31。EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pIJ773,其小片段与pUC19经同样双酶切后的片段酶连克隆,得新质粒pFD32。pFD31和pFD32再分别经SacⅠ酶切,将pFD31含cat的小片段和pFD32的大片段酶连克隆,筛选得重组质粒pFD33,EcoRⅠ与HindⅢ酶切,将切下的两个小片段与pIJ773经同样双酶切后的大片段进行酶连克隆,最终得筛选质粒pIJ792。结果新质粒pIJ792的抗氯霉素能力超过150μg.mL-1。结论 pIJ792可满足金色链霉菌基因打靶的筛选需要,实现了用于金色链霉菌PCR基因打靶所需筛选体系的构建。