南昌霉素高产菌株的链霉素抗性基因突变诱变筛选研究

通过链霉素对南昌霉素 (Nanchangmycin)产生菌NS 41 80菌株孢子的致死浓度测定基础上 ,采用诱变剂甲基磺酸乙酯 (EMS)的不同诱变剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,诱变处理的孢子涂布在含链霉素 ( 1 0 μg/mL)致死浓度的高氏平板上 ,获得了大量的链霉素抗性基因 (str)突变株。然后从 3,0 0 0株链霉素抗性基因 (str)突变株中通过初筛获得比诱变出发菌株产素能力提高 2 0 %以上的菌株 2 0 2株。再进一步通过摇瓶复筛 ,获得比出发菌株产素能力分别提高 1 0 0 %、 2 0 0 %和 30 0 %高产菌株为 48株 ,7株和 1株 ,分别为复筛菌和初筛菌株的 2 3 76%和 1 60 % ;3 46%和 0 2 3% ;0 5 %和 0 0 3%。将产素能力提高 2 4 0 %以上 5个菌株连同出发菌株连续 3批次进行摇瓶发酵结果 ,5个突变株的产素能力均比出发菌株的产素能力提高 5 7%～ 96 4% ,其中突变株 80 5 3 1 65菌株摇瓶发酵单位达 6,0 0 0 μg/mL以上 ,3批次摇瓶平均发酵单位达 5 ,85 5 μg/mL。建立了南昌霉素高产菌株的链霉素抗性基因突变诱变快速高效的筛选方法。

以新霉素抗性基因突变体为筛选标志的真核表达载体的构建

新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之失去抗菌活性。通过对真核表达载体的筛选标志基因neo进行定点突变 ,以降低NPTⅡ的活性 ,然后用含neo突变体的真核表达载体pmDNA构建荧光素酶表达质粒 ,稳定转染CHO K1细胞 ,发现表达荧光素酶的阳性细胞比例达到 95 % 。

梅岭霉素高产菌株链霉素抗性基因突变株筛选

通过链霉素对梅岭霉素 (Meilingmycin)产生菌南昌链霉菌NS 41 80菌株孢子致死浓度的测定 ,采用诱变剂EMS 4种不同剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,然后涂布在含链霉素致死浓度的高氏平板上 ,获得了大量的链霉素抗性基因 (str)突变株。并进一步筛选到梅岭霉素高产菌株 80 5 1 1 2 2 1 ,在摇瓶条件下 ,只产梅岭霉素不产南昌霉素 ,梅岭霉素活性单位达 1 ,52 1 μg/mL,比NS 41 80的摇瓶发酵单位 855μg/mL提高了 77 9% ,该菌株连续传 6代进行摇瓶发酵 ,其F2 代和F3 代发酵单位稳定 ,F4代至F6 代随着代数增加 ,梅岭霉素发酵单位急速下降。通过EMS诱变剂量分别与抗药性突变率和str突变株产梅岭霉素产量的产势统计分析表明 ,菌株抗药性突变与产量突变密切相关。产量突变的EMS剂量高于str突变剂量 ,从而建立了梅岭霉素产生菌链霉素抗性基因突变筛选方法。

通过获得链霉素抗性基因突变株筛选小诺霉素高产菌株

通过链霉素对小诺霉素产生菌 (Micromonospora purpura) 49 1 2 #菌株孢子致死浓度的测定 ,采用诱变剂EMS 3种不同诱变剂量对菌株的孢子进行诱变处理 ,诱变处理的孢子涂布在含链霉素致死浓度的改良高氏平板上 ,获得大量的链霉素抗性基因突变株 ,然后从链霉素抗性基因突变株进一步筛选小诺霉素高产菌株 ,获得小诺霉素菌株 49 1 2 3菌株。在摇瓶条件下 ,其产小诺霉素生物活性单位比出发菌株 49 1 2 #的摇瓶发酵单位提高了 40 %以上。小诺霉素的组分比由出发菌株的C2b∶C1a的 5∶5提高到 8∶2。C2b有效组分提高了 30 %;链霉素抗性基因突变与小诺霉素发酵单位突变之间 ,小诺霉素正突变率达到 40 %,负突变率达 2 6%。

从氯霉素抗性突变株筛选赤霉素高产菌株

应用氯霉素抗性筛选法,将经NTG诱变处理的赤霉素产生菌——水稻恶苗病菌6028菌株(Gibberellafujikuroi6028)原生质体涂布在含有氯霉素2000μg/ml的致死再生培养基平板上,获得了大量氯霉素抗性突变株,其中赤霉素产量高于出发菌的阳性效率达20%,同时获得了在20和60吨罐上产素能力和发酵总亿比出发菌株分别提高7.58%和9.36%的7106高产菌株,且该菌株经连续5次传代试验,产素能力无明显变化。

通过获得链霉素抗性基因(str)突变株筛选梅岭霉素高产菌株

本文通过链霉素对梅岭霉素 (meilingmycin)产生菌南昌链霉菌NS 41 80菌株孢子致死浓度的测定 ,采用诱变剂EMS四种不同诱变剂量对菌株的孢子进行诱变处理 ,诱变处理的孢子涂布在含链霉素致死浓度的高氏平板上 ,获得了大量的链霉素抗性基因 (str)突变株。然后从链霉素抗性基因突变株进一步筛选到梅岭霉素高产菌株 80 5 .11 2 2 1,在摇瓶条件下 ,只产梅岭霉素不产南昌霉素 ,梅岭霉素活性效价达 15 0 0 μg/ml,比出发菌株NS 41 80的摇瓶发酵效价 85 5 μg/ml提高了 77.9%,该菌株连续传代六代进行摇瓶发酵 ,其F2 代和F3 代梅岭霉素发酵效价稳定 ,F4代至F6代随着传代数增加 ,其梅岭霉素发酵效价急速下降。通过EMS诱变剂量分别与抗药性突变率和链霉素抗性基因突变株产梅岭霉素产量的产势统计分析表明 ,菌株抗药性突变与产抗生素突变密切相关 ,产抗生素突变的EMS诱变剂量高于链霉素抗性基因突变诱变剂量。在 0 .0 3mol/L的EMS剂量作用下 ,菌株致死率为 99.43 %,而抗药性突变率为 0 .0 44 0 %,建立了梅岭霉素产生菌链霉素抗性基因突变筛选方法 ,为南昌链霉菌高产菌种选育研究作了有益的尝试 。

杀虫抗生素高产菌株的选育

在链霉素对杀虫抗生素菌株GX-29孢子的致死浓度测定基础上,采用紫外和微波诱变相结合的方法对菌株孢子进行诱变处理,诱变处理的孢子涂布在含链霉素最小抑制浓度(18.2μg/ml)的高氏平板上,获得了大量的链霉素抗性基因(sty)突变株。进一步通过摇瓶复筛,获得高产突变株L8,其摇瓶发酵的杀虫活性为出发菌株1.94倍。该菌株经多次传代,遗传性状较稳定。