大菱鲆肠道乳杆菌Lactobacillus sp.N5的筛选鉴定及其抑制水产病原菌的研究

从大菱鲆(Scophthalmus maximus)肠道内分离出8株乳酸菌,经16S rDNA鉴定为Lactobacillus sp.,以对水产病原菌的抑制和对抗生素的敏感性为指标,研究乳酸菌的特性。其中,菌株N5对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均具有较强的抑制作用,对氨苄青霉素、庆大霉素和罗红霉素敏感。菌株N5发酵上清液经加热、排酸和过氧化氢酶处理后,仍有抑菌作用;经蛋白酶处理后失去抑菌能力,推测菌株N5分泌的抑菌物质为耐热的乳酸菌素,其可以抑制病原菌生物膜的形成。菌株N5在凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)肠道定植5 d后,加入鳗弧菌和哈维氏弧菌,继续养殖7 d,死亡率显著降低。本研究结果可为菌株N5制备水产养殖益生菌剂提供实验依据。

枸杞提取物绿色合成纳米银及其对水产病原菌的抑制

以枸杞提取液作为还原剂和稳定剂,硝酸银为银源,采用生物合成法制备纳米银粒子(AgNPs),并运用透射电子显微镜(TEM)、紫外-可见(UV-vis)吸收光谱、X射线衍射(XRD)和Zeta电位等方法,对制得的AgNPs的形貌、光学特性、晶体结构和稳定性进行表征.研究表明,在合成温度为95℃时,枸杞提取液能够将硝酸银还原成粒径分布均匀和分散性、稳定性良好的AgNPs.以此为基础,研究AgNPs对鳗弧菌、灿烂弧菌、点状产气单胞菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和溶藻弧菌6种常见水产病原菌的抑菌活性.结果表明,枸杞提取液合成的AgNPs对这6种病原菌均有显著的抑制效果;3.0μg/mL AgNPs溶液对鳗弧菌的生长具有明显的抑制作用,对鳗弧菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为1.7μg/mL和3.4μg/mL.枸杞提取液合成的AgNPs对水产病原菌具有极好的抑制作用和杀灭效果,在水产养殖行业具有良好的应用前景.

山楂提取物生物合成纳米银对四种常见水产病原菌的抑制作用

近年来,"绿色"生物合成纳米抑菌材料以其方法简单、价格低廉、环境友好的优势已成为纳米技术领域中的一项激动人心的发展策略。为了研究生物合成纳米银(Silver nanoparticles,Ag NPs)对水产病原菌的抑菌效果,本研究分别以山楂果实超纯水提取物和山楂乙醇提取物作为还原剂和稳定剂,采用生物合成法制备出两种纳米银抑菌材料W-Ag NPs和E-Ag NPs。通过紫外-可见吸收光谱(UV-vis)、透射电镜(TEM)和X射线衍射(XRD)等方法对合成产物的光学特性、形貌特征以及晶体结构等指标进行了比较,并采用琼脂扩散法初步检测了W-Ag NPs和E-Ag NPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种典型病原菌的抑菌活性。研究结果显示,W-Ag NPs的合成效果较为理想,它的粒径较小、更加均一,并且具有较高的抑菌活性。在此基础上,我们进一步检测了W-Ag NPs对鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及点状气单胞菌等4种典型的水产病原菌的抑菌圈,并测定了其抑菌动力学曲线、最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。研究结果表明,W-Ag NPs对四种供试水产病原菌均有显著的抑菌效果,10μg/m L和20μg/m L的W-Ag NPs均对鳗弧菌的生长产生明显的抑制作用,对鳗弧菌的MIC和MBC分别为6.5μg/m L和12.9μg/m L。研究表明山楂提取物制备的纳米银抑菌剂对水产病原菌有显著的抑制和杀灭效果,在水产养殖领域中有着广阔的开发和利用前景。

3种水产病原菌简型基因芯片检测技术的建立

根据水产养殖中常见的3种病原菌鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的研究资料,筛选3个毒力相关基因toxR、aerA、evpA设计引物和探针,构建简型基因芯片,并使用对虾白斑病综合征病毒(WSSV)variable region的PCR荧光标记产物作为表面化学质控。通过已构建和优化的多重PCR反应条件,获得了3个目的基因的PCR产物;经过芯片制作过程的优化,将探针以终浓度20μmol/L溶于50%DMSO,在室温、相对湿度45%的条件下点印于醛基基片表面。扩增的PCR产物与杂交液混合后,在42℃杂交2 h就可检测到理想的杂交信号。芯片的灵敏度试验结果表明,可以检测到的3种水产病原菌的最低模板DNA为:鳗弧菌3×102拷贝、嗜水气单胞菌5×103拷贝、迟缓爱德华氏菌6×101拷贝。该芯片可成功应用于患病大菱鲆内脏的细菌分离物的鉴定。

江苏主要水产病原菌耐药谱系监测

对2006—2009年期间收集自江苏境内的480株水产病原菌进行了菌种鉴定及耐药率统计,监测了江苏省主要水产病原菌的耐药率变迁状况,绘制了菌株对常见药物的耐药谱。结果显示,分离菌株以革兰氏阴性菌(G-)为主,占92.2%,呈上升趋势(χ2=34.103,P<0.01);主要集中在弧菌科的3个属:弧菌属、气单胞菌属和邻气单胞菌属,其中以气单胞菌属最多,占总数72.28%;各属病原菌对喹诺酮类、氯霉素类、磺胺类、氨基糖苷类、四环素类及β-内酰胺类等常见药物均有不同程度的耐药性,耐药率总体呈逐年上升趋势;高达62.5%的菌株对喹诺酮类药物耐药,对氯霉素类和四环素类的总体耐药率则维持在较低水平,分别为11.85%和10.35%;交叉耐药、多重耐药现象严重,超过98%的分离菌株至少有1种耐药标记,有3种耐药标记接近75%。耐药性的产生与扩散已成为当前渔业细菌性疾病防控的突出问题。

苍术和番石榴的不同炮制方法及部位对水产病原菌抑制效果的影响

采用微量稀释法,以溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、哈维弧菌(V.harveyi)、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp piscicida)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、摩氏摩根氏菌(Morganella fulton)、创伤弧菌(V.vulnificus)6种病原菌共7株为受试菌,研究苍术(Atractylodes lancea)不同炮制品和番石榴(Psidium guajava)不同部位的抑菌作用,并进一步测定其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示,番石榴叶和枝果部位以及苍术不同炮制品对溶珊瑚弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种和哈维弧菌抑菌效果较明显,MIC和MBC分别为10-3g·mL-1和10-1g·mL-1,抑菌效果由高至低依次为番石榴叶>番石榴果>番石榴枝,麸炒苍术>盐炙苍术>苍术>醋炙苍术。

绿色合成纳米银材料的制备及其对水产病原菌的抗菌效果测定

近年来随着水产养殖规模不断扩大,渔药安全问题备受重视。为积极寻找抗生素替代品,本研究采用银杏叶提取物和硝酸银反应合成纳米银材料,并通过紫外-可见光全波段扫描、透射电镜以及X射线衍射对其结构表征进行鉴定。在此基础上,以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌,以及水产病原菌迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌为测试对象,采用杯碟法、常量肉汤稀释法以及抑菌动力学实验测定合成的纳米银抗菌效果。结果显示,在波长450 nm处有纳米银等离子共振体形成的吸收峰;透射电镜观察到纳米银颗粒平均直径小于10 nm;X射线衍射图谱验证了金属银的生成;本研究所合成的纳米银材料对4种病原菌均有良好的抗菌效果。研究表明,采用银杏叶绿色合成纳米银,不仅方便、快捷,而且成本低廉、环境友好,在水产病害防控中具有良好的前景。

水产病原菌抗菌药物敏感试验标准化探讨

病原菌药物敏感试验是临床微生物学研究的重要手段,相比人类和兽医临床,国内外水产养殖中细菌性病原的药敏试验还未有公认的标准化参考方法。概括近几年国外对水产病原菌药敏试验标准化方法建立的研究进展,探讨了试验中关键因子的影响,指出我国水产药敏试验中存在的不足及对未来发展提出展望。

载铜蒙脱石对水产病原菌的抗菌活性及其机理

通过阳离子交换反应,合成载铜蒙脱石,并研究它对水产病原菌的抗菌效果。X射线衍射分析显示:载铜反应前后,蒙脱石的(001)面网间距从原先的1.544 nm增加到了1.588 nm,表明铜是以水合阳离子或复合阳离子形式进入蒙脱石晶格层间位置。体外抗菌试验表明:蒙脱石未显抗菌活性,而载铜蒙脱石对所试水产病原菌均有很强的抑制和杀灭作用,它对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌的最小抑菌浓度分别为150,150,75 mg/L,最小杀菌浓度分别为600,600,300 mg/L。载铜蒙脱石的抗菌能力是两方面因素的协同作用:一方面是其表面剩余正电荷能从水介质中大量吸附表面带负电荷的细菌;另一方面是矿物释放的铜离子对细菌的抑制和杀灭作用。

杀灭水产病原菌的放线菌筛选及防治试验研究

从辽宁、山东、浙江、福建、广西、海南、陕西7个省份的近海海域或淡水水体中采集的污泥样品中,分离到86株淡水放线菌和77株海洋放线菌。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、肠型点状产气单胞菌(Aeromonas punctata f.instestinalis)、大肠杆菌(Eschenchia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为指示菌,进行抗菌活性筛选,初筛采用琼脂扩散法,复筛采用挖孔法,获得6株杀菌作用强的放线菌。对这6株菌进行形态特征、培养特征观察以及生理生化试验,初步确定6株菌均属于链霉菌属。选择编号为F1-F-12的放线菌进行鲫鱼防治试验,结果显示,治疗组鲫鱼体内气单胞菌数量与对照组相比明显减少且差异显著(P<0.05),可见杀菌放线菌对水产病原菌有较好的杀灭作用,可用于新型微生物渔药的开发。

面向水产病原菌微流控检测的磁控分离方法

水产养殖环境中病原菌是导致水产养殖病害的主要原因,针对传统方法存在耗时长、试剂成本高、目标菌难分离及自动化程度低等缺点,开展了面向水产病原菌微流控检测的磁控分离方法的研究。设计了磁控捕获及分离等功能的专用磁场控制器,构建了基于微流控芯片的磁控分离实验平台,优化选择了磁极电流、磁控频率及捕获时间等参数,并以大肠杆菌E.coli O157:H7为例对磁控分离捕获率进行了实验验证,研究结果表明,磁控分离法捕获率可达到92%以上,与被动分离捕获方式相比,不仅捕获率提高30%,而且分离操作灵活可控,自动化水平较高,实现了水产病原菌的高效分离,也为后续水产养殖病害快速检测与预警提供保障。

生防细菌K2-1抗菌蛋白纯化及其拮抗水产病原菌分析（英文）

[目的]纯化源自生防细菌K2-1的抗菌蛋白并进行抗菌蛋白于体外对主要水产病原菌的拮抗分析。[方法]利用硫酸铵沉淀,而后透析,获得抗菌蛋白粗品,应用凝胶色谱结合水浴,进一步对抗菌蛋白粗品进行纯化;采用琼脂扩散法,进行抗菌蛋白体外拮抗溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌及鳗弧菌实验,分析其抗菌活性。[结果]应用上述分离纯化方法,获得色谱纯的抗菌蛋白APK2,过程回收率为0.08%,拮抗实验表明,该抗菌蛋白对多数应试病原菌具有较强的抑制作用。[结论]抗菌蛋白APK2有可能作为化学抗生素的替代品,用于水产细菌病的绿色防治。

数字PCR技术在水产病原菌检测中的应用

数字PCR是一种新兴的基因检测方法,是继常规PCR、实时荧光定量PCR之后的第三代PCR基因检测技术.在传统的水产病原菌的分子检测方法中,普通PCR检测结果需要通过琼脂糖凝胶电泳检测、耗时长,并且不能对检测病原进行定量;实时荧光定量PCR技术则需要依赖内参基因进行相对定量分析,难以满足水产病害快速精准检测的需要.数字PCR技术实现了对检测样本的绝对定量分析,具有前所未有的准确度和重现性,为快速准确地进行水产病原菌的检测提供了崭新的技术平台,具有广阔的发展和应用前景.本文主要介绍了数字PCR的产生、原理和分类,并深入探讨了数字PCR技术在水生生物致病菌和水产品食源性致病菌检测中的应用.

自制环保酵素对水产病原菌的抑制效果及其发酵菌株的分离鉴定

为探讨自制环保酵素对水产病原微生物的抑制作用,该研究对其发酵菌株进行了分离。通过比浊法和平板划线法,确定自制环保酵素对水产病原微生物坎氏弧菌SP-1(Vibrio campbellii SP-1)、哈维氏弧菌SP-1(V.harveyi SP-1)、轮虫弧菌SP-1(V.rotiferianus SP-1)和嗜水气单胞菌245(Aeromonas hydrophila)的最低抑制浓度分别是体积分数是体积分数为11.5%、11%、6.2%和11%,最小杀菌浓度分别是体积分数为16%、16%、16%和12%。攻毒保护试验表明,自制环保酵素无菌上清液可使嗜水气单胞菌对斑马鱼(Danio rerio)的致死率降低(90.5±6.49)%。pH、温度、蛋白酶敏感性试验显示自制环保酵素的主要抗菌活性物质为酸性物质,对加热和蛋白酶处理稳定。进一步从环保酵素中分离主要发酵菌株,通过ITS序列分析鉴定为库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)。研究结果可为自制环保酵素在水产养殖中对抗细菌性疾病的应用提供理论基础。

具有养殖水质调控及水产病原菌抑制作用的微生物制剂研发

随着我国水产养殖业的蓬勃发展，养殖水体生态环境的污染日益严重，给水产养殖业带来巨大的损失。利用微生物进行养殖水质调控及水产病原菌抑制是一种环保安全的水质处理技术和方法。一方面达到调控水质、减少养殖自身污染、病害防治的目的，节省了渔药支出；另一方面也降低了饲料系数，提高了产量，增加了利润。

8种中草药对常见水产病原菌的抑制作用

为解决水产养殖业中细菌性疾病及抗生素滥用问题,研究了中草药对几种水产病原菌的抑菌效果。以嗜水气单胞菌、海豚链球菌等8种常见水产病原菌为研究对象,选用黄芩、冬青等8种中草药,测定其水提物及醇提物对上述8种菌的最小抑菌浓度（MIC）,并将结果与6-间甲氧磺胺嘧啶、头孢哌酮等11种抗生素的抑菌效果进行比较。结果表明：在所测试的细菌中,黄芩、冬青、生姜的MIC达到4 mg/m L,厚朴、艾叶、两面针的MIC达到10 mg/m L,黄柏、栀子的MIC达到20 mg/m L,而抗生素的MIC达到0. 1μg/m L。总体而言,黄芩、冬青的抑菌效果较好,中草药醇提物的抑菌效果优于水提物,而抗生素的抑菌效果优于中草药提取物。

黄芩对7种水产动物病原菌的体外抑菌活性研究

采用纸片扩散法和二倍稀释法,利用黄芩水提液对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、温和气单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌进行最低抑菌质量浓度和最低杀菌浓度的测定。试验结果表明,黄芩对鳗弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌效果,最低抑菌质量浓度均为15.63 mg/ml,最低杀菌质量浓度分别为31.25、15.63、31.25、31.25 mg/ml;黄芩对大肠杆菌、温和气单胞菌和哈维氏弧菌的抑菌效果弱于副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌,最低抑菌质量浓度分别为31.25、62.51、31.25 mg/ml,最低杀菌质量浓度分别为62.5、62.5、125 mg/ml。

BIOLOG自动微生物鉴定系统在水产动物病原菌检测中的应用

[目的]了解BIOLOG自动微生物鉴定系统对水产动物病原菌鉴定结果的可靠性,为水产动物细菌性疾病的诊断提供参考。[方法]选用BIOLOG自动微生物鉴定系统对9株分离自发病水产动物的病原菌进行鉴定,同时采用16S rDNA序列分析对其中的4株进行鉴定,比较2种鉴定结果的符合率。[结果]采用自动微生物鉴定系统对9株病原菌进行鉴定均取得良好结果,采用16S rDNA序列分析对4株病原菌进行鉴定的结果与应用自动微生物鉴定系统所得结果完全一致,二者符合率为100%。[结论]应用BIOLOG自动微生物鉴定系统对水产动物病原菌进行鉴定具有操作简便、快速、准确等特点,是实验室鉴定水产动物病原菌的一种可行方法。

两种海藻提取物抗水产动物病原菌活性的初步研究

研究了两种大型海藻——羊栖菜(Sargassum fusiforme)、条浒苔(Enteromorpha clathrata)提取物对11种水产动物病原菌的抑制活性。结果显示:羊栖菜乙醇粗提物乙酸乙酯相对溶藻弧菌(Vibrio algi-nolyticus)的抑制作用最明显,抑菌圈可达21.6 mm;薄层层析表明羊栖菜乙醇粗提取物乙酸乙酯相有6条层析带,其中Rf=0.54带对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑制作用最强,抑菌圈可达13.6 mm;条浒苔乙醚粗脂对11种水产动物病原菌均表现出了较强的抑制作用,其中对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)的抑制作用最强,抑菌圈可达24.7 mm;进一步的实验显示,条浒苔乙醚粗脂3种洗脱组分抗菌性均比粗脂减弱了,而其95%乙醇洗脱组分对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的抑菌圈仍可达13.8 mm。说明利用羊栖菜、条浒苔为开发海洋药物资源提供了可能。

快速检测病原菌含量的简易微流控系统

针对现有水产养殖病原菌检测时效性差、自动化程度低的缺点,提出了一种快速检测水产养殖病原菌含量的简易微流控系统研究方法。该系统将微电极构造于微流控芯片通道底部并与数字阻抗测量电路连接,通过在磁珠表面包被水产病原菌抗体,利用外部高斯磁场控制诱导磁珠捕获水产病原菌,并将水产病原菌与磁珠结合体带至微电极阵列,通过在电极端构建基于阻抗测量的计数电路,从而有效检测水产病原菌含量。研究结果表明该系统能够有效测量水产病原菌的含量,检测时间由传统的平板计数法48 h减少至30 min,检测效率提高为原来的60多倍,检出限相比现有的微流控阻抗法缩小100倍。