利用多重RT-PCR检测水仙黄条病毒、水仙退化病毒和水仙花叶病毒

根据水仙黄条病毒、水仙退化病毒和水仙花叶病毒外壳蛋白(CP)基因的保守区序列设计3对特异性引物,通过优化包括Mg2+浓度、c DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度等在内的反应条件,建立了能同时检测这3种病毒的多重RT-PCR检测体系,并与单一RT-PCR做了比较.应用该体系能成功对3种病毒混合侵染的水仙样品进行多重RT-PCR扩增,获得751、623和483 bp 3条与预期大小相符的特异性条带,且RNA稀释至10-4倍时仍能被检测到.建立的多重RT-PCR检测体系具有良好的特异性和较高的灵敏度,比单一RT-PCR扩增更加方便、快速.

应用巢式RT-PCR检测水仙退化病毒1

水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus,NDV)是水仙上发生较为严重的病毒之一。本文根据NDV已报道的外壳蛋白基因序列,设计特异性引物,以感病水仙的总RNA为模板,建立了快速检测NDV的巢式RT-PCR方法。结果表明,巢式RT-PCR具有良好的特异性和灵敏度,能够从感染NDV的水仙样品上扩增出与预期大小相符的特异性目的条带,同时与其他病毒无交叉反应;灵敏度测定结果表示,巢式RT-PCR灵敏度较高,是普通RT-PCR的104倍,当RNA稀释到109倍时仍能被检测到。本文建立的巢式RT-PCR为水仙上NDV的快速检测提供了技术参考依据。

水仙黄条病毒和水仙退化病毒的种群结构及遗传多样性特征

为防控水仙黄条病毒(narcissus yellow stripe virus,NYSV)和水仙退化病毒(narcissus degen‐eration virus,NDV),于2017年4月在江苏省2个市采集24个水仙病样,通过逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测,从6个水仙样品中获得与预期大小一致的核苷酸片段,通过克隆CP基因和序列分析,结合GenBank中已报道的相关序列对所获得的4条NYSV序列和2条NDV序列进行种群结构及遗传多样性分析。结果显示,仅在NYSV CP基因中发现4个重组位点;NYSV CP多样性程度很高,相似值高于75%,而NDV CP相似值高达96%;在系统发育树中,NYSV分离物被分为4组,NDV分离物被分为2组;日本NYSV分离物核苷酸多样性较高,为0.136,而NDV中国种群核苷酸多样性较高,为0.012;NYSV CP基因中II组与III组的遗传距离最高,为0.332,NDV中国分离物与日本分离物间的遗传距离差异明显,为0.104;NYSV中国种群与日本种群的遗传差异为0.166,存在一定的基因交流;NYSV与NDV的CP基因均处于负选择压力作用下。