利用多重RT-PCR检测水仙黄条病毒、水仙退化病毒和水仙花叶病毒

根据水仙黄条病毒、水仙退化病毒和水仙花叶病毒外壳蛋白(CP)基因的保守区序列设计3对特异性引物,通过优化包括Mg2+浓度、c DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度等在内的反应条件,建立了能同时检测这3种病毒的多重RT-PCR检测体系,并与单一RT-PCR做了比较.应用该体系能成功对3种病毒混合侵染的水仙样品进行多重RT-PCR扩增,获得751、623和483 bp 3条与预期大小相符的特异性条带,且RNA稀释至10-4倍时仍能被检测到.建立的多重RT-PCR检测体系具有良好的特异性和较高的灵敏度,比单一RT-PCR扩增更加方便、快速.

一步RT-PCR检测水仙黄条病毒

目的:建立用于快速检测水仙黄条病毒(Narcissus yellow stripe virus,NYSV)的一步RT-PCR方法。方法:根据已报道的NYSV基因序列设计特异性引物,采用一步RT-PCR建立了快速检测水仙黄条病毒的方法。结果:该方法具有良好的特异性,能够从感染水仙黄条病毒的水仙样品上扩增出预期大小的特异性目的片段,而与其他病毒无交叉反应;一步RT-PCR产物序列测定结果表明,该产物的序列与NYSV序列高度同源,同源性达99%;灵敏度测定结果显示,一步法RT-PCR与两步法RT-PCR的灵敏度相当,可以检测稀释到10-4倍的RNA。结论:应用建立的一步RT-PCR对一批水仙样品进行NYSV检测,结果与两步法RT-PCR完全相同,说明该方法可准确用于NYSV的检测。

水仙黄条病毒和水仙退化病毒的种群结构及遗传多样性特征

为防控水仙黄条病毒(narcissus yellow stripe virus,NYSV)和水仙退化病毒(narcissus degen‐eration virus,NDV),于2017年4月在江苏省2个市采集24个水仙病样,通过逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测,从6个水仙样品中获得与预期大小一致的核苷酸片段,通过克隆CP基因和序列分析,结合GenBank中已报道的相关序列对所获得的4条NYSV序列和2条NDV序列进行种群结构及遗传多样性分析。结果显示,仅在NYSV CP基因中发现4个重组位点;NYSV CP多样性程度很高,相似值高于75%,而NDV CP相似值高达96%;在系统发育树中,NYSV分离物被分为4组,NDV分离物被分为2组;日本NYSV分离物核苷酸多样性较高,为0.136,而NDV中国种群核苷酸多样性较高,为0.012;NYSV CP基因中II组与III组的遗传距离最高,为0.332,NDV中国分离物与日本分离物间的遗传距离差异明显,为0.104;NYSV中国种群与日本种群的遗传差异为0.166,存在一定的基因交流;NYSV与NDV的CP基因均处于负选择压力作用下。