高纯度RBP4抗体的制备及在水动力转染小鼠肝癌模型中的应用

目的:制备高纯度视黄醇结合蛋白4(RBP4)单克隆抗体并应用其检测高压水动力转染小鼠肝癌模型中RBP4的表达水平。方法:将RBP4重组蛋白表达菌株培养并诱导表达,使用AKTA系统纯化蛋白,通过杂交瘤的方式制备高纯度RBP4单克隆抗体;将7周龄SPF级C57BL/6J小鼠随机分为实验组和对照组,每组6只,雌雄各半,利用高压水动力转染法联合SB11转座子系统与CRISPR/Cas9系统构建实验组小鼠肝癌模型;将RBP4单克隆抗体应用于免疫组化法检测小鼠肝癌组织中RBP4的表达水平。结果:成功获得纯度95%以上的重组RBP4蛋白,制备RBP4单克隆抗体过程中杂交瘤细胞融合率60%,最终获得3株阳性单克隆细胞株,经纯化获得高效价(1∶243 000)、高纯度(96.77%)单克隆抗体。成功建立高压水动力转染小鼠肝癌模型,实验组肝癌发生率100%,肝脏呈现典型肝癌病理特征,对照未出现肝癌。利用制备的RBP4单克隆抗体进行免疫组化检测,发现实验组肝癌组织中RBP4表达水平显著低于对照组(P<0.001)。结论:本研究制备的RBP4单克隆抗体具有高效价和高纯度特点,RBP4蛋白表达水平在高压水动力转染小鼠肝癌组织中明显降低,RBP4与肝癌发生和发展的关系值得进一步研究。

水动力转染鸡PPARγ基因在小鼠肝脏中的表达

采用水动力转染技术将含有家鸡PPARγ基因的真核表达质粒、表达该基因siRNA的干扰质粒注射到小鼠体内,并利用RT-PCR方法检测PPARγ基因在小鼠脏器中的表达情况,以建立检测重组质粒瞬时表达和筛选siRNA序列的有效方法。结果表明:注射重组质粒pcDNA3/PPARγ后家鸡PPARγ基因在小鼠的肝脏中高效表达;同时注射重组质粒pcDNA3/PPARγ和表达该基因siRNA序列的干扰质粒pGenesil-1/PPARγshRNA1后,家鸡PPARγ基因在小鼠肝脏中的表达明显地受到抑制。与传统的真核细胞转染技术相比,水动力转染技术具有快速、简单、方便、高效、安全、成本低等优点,可作为外源重组DNA表达的检测和siRNA的筛选等一种有效的方法。

应用水动力转染技术使人低密度脂蛋白受体、CD81和浸入诱导蛋白L同时在小鼠体内表达

为建立人低密度脂蛋白受体(LDLR)、CD81和浸入诱导蛋白L(Sip-L)等多个HCV感染相关分子共表达的转基因小鼠,首先分别构建了白蛋白启动子调控的人LDLR、CD81和Sip-L基因的小鼠肝脏组织特异性表达载体,将3种质粒同时采用水动力转染技术导入小鼠体内,RT-PCR和免疫组化技术检测转入体内基因的表达及持续时间。结果表明,转染8h后即可检测到3种基因在体内转录,人LDLR和CD81在转染1～4d后可在50%～90%的肝细胞中高效表达,7d后检测不到目的基因表达。为了进一步延长转染基因在小鼠体内的表达时间,又分别构建了人LDLR、CD81和Sip-L的染色体整合型表达载体,将它们与噬菌体ФC31的整合酶表达载体同时水动力转染小鼠,3种基因在体内表达时间可持续到转染后25d。以上结果表明建立了多个HCV感染相关分子共表达的转基因小鼠,为确定这些分子能否使小鼠感染HCV奠定了基础。

微环载体结合水动力转染技术制备乙肝病毒受体小鼠模型

目的制备乙肝病毒受体钠离子/牛磺胆酸共转运多肽(Na+/taurocholate co-transporting polypeptide,NTCP)小鼠基因转染模型,为乙肝的防治研究提供动物模型。方法制备携带人NTCP真核表达框的亲本质粒ZY781-CMV-NTCP及微环DNA p MC-CMV-h NTCP,采用水动力转染技术将微环DNA p MC-CMV-h NTCP经尾静脉注入ICR小鼠体内,采用PCR和免疫组化方法检测NTCP基因在小鼠体内的表达情况。结果成功构建了携带人NTCP基因的微环载体。PCR检测表明人NTCP基因成功转入小鼠肝组织内,同时肝组织免疫组化检测表明h NTCP可以在小鼠的肝脏内表达。结论成功制备出乙肝病毒受体(NTCP)基因转染小鼠模型。

水动力转染技术建造慢性乙型肝炎动物模型特效研究

目的比较不同质粒建立的水动力转染乙型肝炎小鼠模型的特性。方法将pc DNA 3.1-1.3-HBV-C与PAAV-1.2-HBV-A两种质粒通过水动力转染法建立两种乙型肝炎小鼠模型,通过对建模成功率和小鼠外周血HBs Ag滴度及稳定性,T细胞指数流式等检测分析,比较不同模型差异和特效。结果转染pc DNA3.1-1.3-HBV-C质粒建模成功率为78.6%,转染后体内HBs Ag滴度最高达到220IU/m L;转染PAAV-1.2-HBV-A质粒建模成功率为56%,转染后体内HBs Ag滴度最高达到2 300IU/m L。建模小鼠的肝脏进行切片,做免疫组化后,观察实验结果,转染pc DNA 3.1-1.3-HBV-C质粒的小鼠肝脏切片的HBs Ag免疫组化较PAAV-1.2-HBV-A质粒小鼠颜色面积更大。实验小鼠转染质粒后6周的外周血进行流式细胞术检测,结果显示特异性T细胞CD4+、CD8+和正常小鼠比较,两种质粒的造模小鼠未有差别。结论利用水动力转染法用不同质粒建造乙型肝炎小鼠模型在乙肝病毒指标水平和稳定性方面有着显著差异。

水动力转染技术及其在肝炎病毒实验动物模型研究中的应用

水动力转染方法是指从小鼠尾静脉快速注射大体积含目的基因的生理盐水,从而实现外源基因在小鼠体内(尤其是肝脏内)的高效表达。它作为一种快速、简单、高效、安全的外源基因转染方法,已经广泛用于体内基因功能、基因调节、蛋白表达和基因治疗等方面的研究。由于该方法转染的目的基因主要在小鼠体内肝脏获得高水平表达,特别适用于肝炎病毒功能基因小鼠体内表达模型的建立。利用该技术建立的肝炎病毒实验动物模型有助于促进肝炎病毒致病机制的研究以及抗病毒药物的体内筛选与评价。

基于高压水动力注射基因转染法构建小鼠原发性肝癌模型的方法及研究进展

原发性肝癌发病率和死亡率不断上升,在预防、诊断和治疗方面对全球健康提出了更高挑战。建立原发性肝癌动物模型是筛选潜在治疗靶点和开展临床前研究的必要条件。基于高压水动力注射基因转染法构建小鼠原发性肝癌模型具有可靠、快速、灵活和节约成本等优势,为更好地了解人类肝癌的分子发病机制,测试抗肝癌药物的治疗潜力等提供了有效途径,近二十年来逐渐被研究者们应用。本文以高压水动力注射基因转染构建小鼠原发性肝癌模型的基本原理为切入点,综述该模型的具体构建方法及其近年来的研究进展,以期为原发性肝癌的临床前研究提供有价值的参考。

乙型肝炎病毒动物模型研究进展

乙型肝炎病毒感染是全球范围影响人类健康的重要问题,慢性感染人群存在肝硬化和肝细胞癌的高患病风险。尽管乙型肝炎病毒疫苗有效,但是在世界范围内慢性感染人数超过了3.5亿,占全球人数的5%。乙型肝炎病毒的生物学研究及新治疗发展进展缓慢是由于缺乏合适的动物模型,每一种动物模型都有其优势和特殊弊端。简要综述了各种动物模型在乙型肝炎病毒研究中的应用进展。

白桦脂酸对质粒急性感染模型小鼠的HBV DNA抑制作用研究

桦木酸是一种天然存在的五环三萜系化合物,它具有抗逆转录病毒,抗疟疾和抗炎特性。该研究主要目的是观察白桦脂酸对Payw1.3质粒急性感染小鼠模型的HBV DNA复制的抑制作用。实验的Payw1.3质粒急性感染小鼠模型(n=15)采用水动力转染技术构建,随机分为PBS对照组(n=5),白桦脂酸药物治疗组(n=5)及拉米夫定对照组(n=5),建模成功后次日分别予以白桦脂酸(100 mg·kg-1),拉米夫定(50 mg·kg-1),PBS药物灌胃,每日1次,连续7 d,分别在3,5,7 d眼眶静脉后采血,ELISA法测血清中HBsAg及HBeAg表达,并在7 d后处死小鼠,southern法检测肝组织HBV DNA表达。结果发现与PBS对照组相比,5 d时白桦脂酸能明显抑制Payw1.3质粒急性感染小鼠HBsAg表达(P<0.05),与拉米夫定效果无明显差异。与对照组相比,白桦脂酸和拉米夫定对HBeAg表达均无明显抑制作用,白桦脂酸和拉米夫定对肝组织HBV DNA表达均有抑制作用。这些结果揭示了白桦脂酸能够抑制Payw1.3质粒急性感染小鼠血清HBsAg表达及肝脏内HBV DNA的复制。

荧光素酶报告基因标记的HBV小鼠模型的建立

建立萤火虫荧光素酶(Fluc)为报告基因标记的乙型肝炎病毒(HBV)小鼠模型。通过水动力转染10μg质粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2分别导入C57BL/6和BALB/c小鼠肝细胞内,定期取血检测HBsAg和HBV-DNA水平,活体成像检测Fluc在小鼠的表达。在BALB/c小鼠中,血清HBsAg表达水平在转染后第1w内迅速升高,随后快速下降。而在C57BL/6小鼠中,HBsAg表达水平下降较缓慢。血清病毒滴度在转染后第1d平均达到3.89×104copy/ml,在第4d和第7d达到最高,分别为1.61×105和1.31×105copy/ml,随后开始下降,在转染的第70d仍维持在103 copy/ml以上。免疫组化检测C57BL/6小鼠肝脏HBcAg的表达,结果显示在转染后第3dHBcAg高水平表达,第135dHBcAg仍有表达,但表达水平降低。活体荧光成像实时检测小鼠肝脏Fluc,结果表明两组小鼠均能持续高水平表达Fluc,转染后第7周Fluc的表达量仍然超过106 photon/s。我们建立的报告基因标记的HBV小鼠模型能够稳定表达HBV标志物和Fluc,为进一步进行HBV的疫苗评价提供了基础。

RUNX1c及GATA2表达质粒构建及其在肝细胞中表达的鉴定

目的构建含RUNX1c及GATA2基因的表达质粒,探讨水动力转染法能否实现其在小鼠肝中的表达。方法采用PCR方法分别扩增RUNX1c及GATA2基因序列,并分别连入T载体中,通过双酶切、连接反应将2个基因序列分别连入慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中。将含RUNX1c及GATA2基因的慢病毒毒液转染至L-02细胞,通过qPCR方法检测目的基因表达。通过水动力高压转染方法将此两种质粒通过尾静脉注入小鼠体内,于转染24 h,取小鼠肝组织,对组织切片进行抗RUNX1及GATA2抗体的免疫荧光染色;于转染72 h,通过流式细胞术分选肝组织中GFP+细胞,实时定量PCR(qPCR)检测RUNX1c、GATA2及造血相关基因的表达。结果经双酶切及测序鉴定证明,pCDH-MCS-T2A-RUNX1c-copGFP-MSCV、pCDH-MCS-T2A-GATA2-copGFP-MSCV质粒构建成功。通过体外实验证实这两个载体携带的RUNX1c及GATA2基因能在人肝细胞系L-02中表达。水动力高压转染法可使含RUNX1c及GATA2的质粒进入肝组织,并在肝细胞中表达RUNX1及GATA2蛋白。通过分选肝组织中GFP+细胞,可发现这些细胞内过表达RUNX1及GATA2基因,Fli-1、Erg基因的表达也明显提高。结论成功构建了含有造血转录因子RUNX1c、GATA2基因的表达载体,并通过水动力转染法实现RUNX1c、GATA2的表达载体在小鼠肝中的表达,为进一步研究肝中过表达造血转录因子能否实现肝细胞转分化为造血细胞及观察其对造血系统修复的作用奠定基础。

小鼠NK细胞体内扩增、分离纯化的方法研究

目的为获得一定数量高纯度的自然杀伤细胞(natural killer cells,NK),拟采用水动力高压转染技术实现Flt-3配体(Flt-3 ligand,FL)基因在小鼠肝的高效表达,以刺激脾NK细胞体内扩增,随后通过优化免疫微磁珠分选(MACS)技术获取大量、高纯度NK细胞,为细胞治疗提供支撑。方法 C57BL/6小鼠经多次水动力高压转染FL表达质粒后,流式细胞术检测脾NK细胞的扩增程度及表型变化,并通过MACS技术分离纯化NK细胞。结果与一次水动力高压转染FL目的质粒的结果相比,两次水动力转染后小鼠脾明显增大,淋巴细胞绝对数量增加(6.02±1.15)倍,NK细胞亚群比例增加(2.07±0.39)倍,NK细胞亚群绝对数量增加(12.49±2.39)倍。同时,FL刺激对NK细胞活性及表型无明显影响。最后,经偶联CD5(Ly-1)磁珠阳选和去除T、B等多种杂细胞磁珠阴选相结合的双重分选方法,可获得纯度为(83.81±0.92)%的NK细胞,较单独阴选纯度提高(1.60±0.02)倍。结论经两次FL表达质粒水动力高压转染,可在不影响NK细胞活性及表型的前提下,实现其在小鼠脾的大量扩增。阳选和阴选相结合的双重MACS分选技术能有效去除T、B等杂细胞影响,获取高纯度NK细胞,为肿瘤细胞免疫治疗奠定基础。

可视化血红素加氧酶-1小鼠模型用于药物肝毒性评价

目的建立实时动态监测药物肝毒性小鼠模型,用于药物肝毒性临床前评价。方法通过水动力高压转染法将表达萤火虫荧光素酶的血红素加氧酶-1(HO-1)报告基因质粒转染到小鼠肝细胞中,建立HO-1-Luc小鼠模型。使用HO-1-Luc小鼠模型动态监测对乙酰氨基酚(APAP)导致的肝损伤以及抗氧化剂谷胱甘肽对药物性肝损伤的治疗效果。结果使用HO-1-Luc小鼠模型通过活体荧光成像的手段能监测到APAP引起的肝毒性,与通过活性氧相关标志物、转氨酶以及组织病理学等经典肝毒性检测手段得到的结果吻合。同时该小鼠模型能够监测到谷胱甘肽对APAP诱导的肝毒性保护作用。结论建立的HO-1-Luc小鼠模型在药物临床前肝毒性评价中具有潜在应用价值。