猪塞内卡病毒A、猪水疱病毒和口蹄疫病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种鉴别猪塞内卡病毒A(SVA)、猪水疱病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对3种病毒的基因保守区域设计引物和探针,建立了可同时检测上述3种病毒的Taq Man三重荧光定量PCR方法。该方法仅能特异性扩增SVA和FMDV病毒基因以及SVDV阳性质粒,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、经典猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒的阳性样品cDNA或DNA无交叉反应,对3种病毒核酸的最低检出限均为10 copies/μL,组内和组间变异系数均小于4%。应用该方法对2019-2022年采集的吉林省部分地区267份病料和本实验室留存的30份猪血清样品进行检测,未检出SVA、FMDV以及SVDV。建立的三重荧光PCR方法有利于对3种病毒进行有效的流行病学调查,可给快速准确鉴别致猪水疱症状病毒性疾病提供诊断方法。

细胞外基质蛋白ABI3BP抗水疱性口炎病毒初步作用研究

目的探讨细胞外基质蛋白ABI3BP对水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)基因组复制和先天免疫信号通路的影响。方法在人皮肤成纤维细胞BJ-5ta中转染小干扰RNA(siRNA)敲低ABI3BP基因,建立ABI3BP基因缺失的VSV-GFP病毒感染细胞模型。通过鬼笔环肽细胞免疫荧光实验,检测敲低ABI3BP后细胞内肌动蛋白(F-actin)形态结构的变化。在ABI3BP基因缺失的VSV-GFP病毒感染细胞模型上,利用RT-qPCR方法检测细胞中病毒mRNA水平的变化。利用免疫印迹法(Western blotting)检测IRF3和TBK1磷酸化水平的变化。结果成功建立敲减ABI3BP基因的VSV-GFP感染的细胞模型。鬼笔环肽细胞免疫荧光染色表明,敲减ABI3BP基因后,细胞内F-actin的表达发生结构重排。采用不同剂量的病毒感染细胞,与对照组相比,ABI3BP敲低细胞中基因拷贝数分别增加2.5~3.5倍(P<0.01)和2.2~4倍(P<0.01),VSV-GFP病毒蛋白表达水平显著上调;在ABI3BP基因敲低的细胞模型上,VSV-GFP病毒感染导致Ⅰ型干扰素免疫通路关键免疫分子p-IRF3和p-TBK1蛋白磷酸化水平明显下调。结论本研究表明细胞外基质蛋白ABI3BP对维持细胞内F-actin纤维网状结构具有重要作用。ABI3BP缺失促进RNA病毒的复制,ABI3BP是I型干扰素通路激活的重要调控分子。

水疱性口炎病毒对小鼠乳腺癌4T1细胞荷瘤小鼠抗肿瘤免疫、移植瘤生长与肺转移的影响

目的:探究野生型水疱性口炎病毒印第安纳株(VSV-IN)对小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞移植模型小鼠的免疫调节及肿瘤转移的影响。方法:VSV以MOI=1、MOI=10、MOI=100感染4T1细胞12、24、48 h后,CCK-8法检测4T1细胞死亡率,划痕愈合实验检测细胞迁移能力,qPCR检测细胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9 mRNA的表达。于雌性BALB/c小鼠脂肪垫接种1×10^(6)个/mL的4T1细胞0.1 mL,构建4T1细胞荷瘤小鼠模型,待小鼠肿瘤体积达200 mm3,分别向移植瘤内注射PBS、紫杉醇(TAX)(15 mg/kg)、VSV-IN(1×10^(6)pfu/只),每周1次。给药4次后,处死小鼠、剥离完整移植瘤组织,测量肿瘤体积及质量,肺组织病理切片经H-E染色后观察肿瘤肺部转移结节,流式细胞术检测脾组织中T细胞亚群比例,ELISA法检测小鼠血清IL-6及TNF-α水平,利用GEPIA在线分析乳腺肿中迁移相关蛋白mRNA的表达,免疫组化法检测肿瘤中MMP-2、MMP-9与E-cadherin的表达,利用蛋白-蛋白对接技术预测VSV-IN的G蛋白、M蛋白与ERK2、E-cadherin的亲和力。结果:经MOI=10、100的VSV-IN处理48 h后,4T1细胞死亡率显著高于对照组(均P<0.01);与对照组相比,VSV-IN组(MOI=10)细胞迁移率明显降低(P<0.01),MMP-9 mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05);与对照组小鼠相比,VSV-IN组移植瘤生长较对照组减缓且终点体积显著减小(P<0.05),VSV-IN组小鼠肺转移结节数量显著减少[(12.86±1.86)vs(24±3.67)个,P<0.01],脾内CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞比例显著升高(均P<0.05),血清TNF-α、IL-6含量显著升高(均P<0.01);GEPIA分析发现在乳腺癌中E-cadherin、MMP-9表达水平均高于癌旁组织(P<0.05);VSV-IN组小鼠肿瘤细胞内MMP-9表达明显低于对照组(P<0.05);VSV-IN的G、M蛋白与ERK2的结合自由能分别为–11.7 kcal/mol、–6.4 kcal/mol。结论:野生型VSV-IN可抑制4T1细胞荷瘤小鼠的移植瘤生长及转移,这可能与其促进抗肿瘤免疫及调控迁移相关蛋白表达有关。

eEF1A1调控水疱性口炎病毒和单纯疱疹病毒复制的初步研究

目的 探讨真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)对水疱性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV-1)复制的影响,以确定一个广谱抗病毒新靶点。方法 在人皮肤成纤维细胞(BJ-5ta)中转染小干扰RNA(sieEF1A1)抑制eEF1A1表达,同时设置阴性对照组,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Western印迹法检测转染效率,制备eEF1A1基因沉默的细胞模型。用VSV感染细胞模型,检测细胞内VSV的基因拷贝数和蛋白水平;用HSV-1感染细胞模型,检测细胞内HSV-1的mRNA水平和蛋白水平。用聚胞苷酸[poly(I:C)]或脱氧核糖核酸钠盐(HT-DNA)分别转染细胞模型,RT-qPCR检测干扰素β(IFN-β)、趋化因子10(CXCL10)和干扰素刺激基因56(ISG56)的mRNA水平,Western印迹法检测干扰素调节因子3(IRF3)和TANK结合激酶1(TBK1)蛋白磷酸化水平。结果 与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组eEF1A1的mRNA水平和蛋白水平显著降低(P<0.01),eEF1A1基因沉默的细胞模型构建成功。与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组的VSV基因拷贝数下降70%~80%,VSV蛋白水平显著降低(P<0.01);HSV-1的mRNA水平下降50%~60%,HSV蛋白水平显著降低(P<0.01)。poly(I:C)或HT-DNA刺激后,与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组的IFN-β、ISG56和CXCL10的mRNA水平以及IRF3与TBK1的蛋白磷酸化水平无显著差异。结论 eEF1A1调控VSV和HSV-1病毒复制,提示eEF1A1对RNA病毒和DNA病毒具有潜在的广谱调控作用,且可能不通过胞内核酸识别激活的免疫通路。

γ-氨基丁酸促进水疱性口炎病毒感染小鼠巨噬细胞

目的探究代谢物γ-氨基丁酸(GABA)对病毒感染RAW264.7细胞系和小鼠原代腹腔巨噬细胞的影响。方法用0、10、30、50和70 mmol/L GABA或PBS处理RAW264.7细胞系10 h,CCK-8法检测细胞活性,用此剂量GABA预处理RAW264.7细胞系,2 h后用表达绿色荧光蛋白的重组水疱性口炎病毒(GFP-VSV)或VSV感染8 h,荧光显微镜观察细胞内GFP-VSV的含量;流式细胞术检测细胞内GFP-VSV的水平;RT-qPCR检测VSV RNA及细胞因子Ifnb1和Il-6的mRNA水平。用0、10、30、50和70 mmol/L GABA预处理小鼠原代腹腔巨噬细胞,2 h后用VSV感染8 h,RT-qPCR检测VSV RNA水平。结果10、30、50和70 mmol/L的GABA对RAW264.7细胞系的活性没有影响,且此剂量的GABA能提高RAW264.7细胞系内GFP-VSV的蛋白水平、VSV RNA水平和细胞因子Ifnb1和Il-6的mRNA水平(P<0.05),也能提高小鼠原代腹腔巨噬细胞内VSV RNA水平(P<0.05),且均呈剂量依赖性。结论代谢物GABA能以剂量依赖的方式促进VSV感染RAW264.7细胞系和小鼠原代腹腔巨噬细胞,同时细胞因子Ifnb1和Il-6的mRNA水平也升高。

多重PCR同时检测口蹄疫病毒、猪水疱病病毒和水疱性口炎病毒

根据基因库中的口蹄疫病毒(FM-DV),猪水疱病病毒(SVDV)和水疱性口炎病毒(VSV)各基因序列,设计了与FMDV,SVDV和VSV互补的3对特异性引物,对样品中的cDNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为189 bp,125 bp和300 bp。用这3对引物对病毒样品cDNA模板进行多次扩增,均能稳定得到与设计相符合的3条特异性条带。本试验能特异、敏感、快速地鉴定FMDV,SVDV和VSV。

表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒印第安纳株的构建

通过负链RNA病毒反向遗传操作技术,成功救获了表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组印地安纳株水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus Indiana serotype)、救获的重组病毒保持了野生型VSV高滴度生长特性,细胞连续传代10次仍保持GFP的稳定表达及生物学特性不变。本研究为VSV作为新型重组活病毒载体疫苗和肿瘤治疗载体研制及基础病毒学相关研究提供了理想的技术平台。

水疱性口炎病毒单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定

用纯化的水疱性口炎毒(VSV)免疫接种Balb/c小鼠,取免疫接种的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,获得4株稳定分泌抗VSV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(5B1、8H1、9B9和11E11)。4株单克隆抗体均能与VSV反应,且不与其他病毒及BHK细胞反应,表明4株单克隆抗体特异性良好。4株单克隆抗体腹水ELISA效价分别为1∶512 000、1∶256000、1∶256 000、1∶1 024 000。本试验为研究VSV生物学特性和建立VSV免疫学检测方法奠定了基础。

水疱性口炎病毒荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立与应用

本研究建立荧光定量RT-PCR鉴别检测水疱性口炎病毒的方法。针对Gen Bank登录的水疱性口炎两血清型-新泽西型(VSV-NJ)和印第安纳型(VSV-IND)的L基因保守区,设计1对引物和2条探针。通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测VSV的方法。与常规RT-PCR试验比较表明,所建立的荧光RT-PCR检测技术快速、敏感,检测时限3 h以内,具有很好的特异性和重复性,可以实现水疱性口炎病毒的快速检测分型。通过对342份临床样品进行检测,结果表明,所建立的检测方法适用于样品中水疱性口炎病毒的直接检测。

稳定表达猪水疱病病毒P1基因的PK-15细胞系的建立

从猪水疱病全长感染性cDNA中,应用PCR技术扩增到SVDV结构蛋白P1基因,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,在Polybrene的介导下感染PK-15细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。免疫荧光连续检测阳性克隆传代细胞,发现在不同代次的细胞中均有SVDV P1蛋白表达,而且表达的蛋白可被SVD阳性血清所识别;同时应用PCR技术,可从体外反复传代阳性细胞基因组中扩增到SVD P1基因。表明本次所筛选的阳性细胞克隆不但能持续稳定地表达SVD P1蛋白,而且可携带外源基因进行传代,具有良好的遗传稳定性。

多重RT-PCR检测猪口蹄疫病毒、猪水泡病病毒和猪水疱性口炎病毒的研究

建立了一种同时检测猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)和猪水疱性口炎病毒(VSV)三种病原体的多重RT-PCR方法。参照文献报道的基因序列,设计合成了三对特异性引物;PCR扩增条件进行优化后,用这三对引物对同一样品中的FMDV、SVDV、VSVRNA模板进行扩增,结果同时得到了三条特异性条带,大小与试验设计相符:FMDV(208bp)、SVDV(862bp)、VSV(638bp),且对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)核酸扩增结果为阴性;三种病毒RNA模板检出的最小量均为10fg。试验证明,此方法经济、快速、敏感、特异,可用于FMDV、SVDV和VSV这三种猪水泡性疾病的鉴别诊断及流行病学调查。

实时荧光定量RT-PCR检测猪水疱病病毒的研究

按照猪水疱病病毒结构蛋白VP1基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了实时荧光定量RT-PCR技术,对猪水疱病病毒进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,实时荧光TaqManRT-PCR可检测到每个反应相当于1×102拷贝病毒RNA;与FMDV、VSV等其他水疱性病毒不发生交叉反应;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.993;与常规的RT-PCR比较,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。

水疱性口炎病毒N基因原核表达载体的构建及表达

针对水疱性口炎病毒(VSV)N基因设计特异性引物,在引物中分别加入EcoR 和Xho 酶切位点。RT-PCR扩增后得到目的基因,将其克隆到表达载体pET30c,连接产物转化于DH5α菌株,在含Kan+的平板上37℃培养24h,然后挑取白色菌落,鉴定为阳性者,转化于BL21菌株,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导获得高效表达。表达融合蛋白分子质量为53ku(目的蛋白大约47ku),同预期蛋白大小相近。Westernblot检测表明,其能与本病毒阳性血清发生特异性反应,表达蛋白有望成为有价值的VSV诊断抗原。

水疱性口炎病毒免提取核酸荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立可快速鉴别水疱性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)免提核酸的荧光定量PCR检测方法,根据VSV-IND和VSV-NJ两种血清型相对保守的L基因序列,设计2对特异性引物和2条探针,探针用不同的荧光基团进行标记。经过对各反应条件的优化,建立了直接从样品中鉴别VSV-IND和VSV-NJ的荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性和敏感性进行分析。结果显示,该直扩荧光定量PCR能准确鉴别VSV-IND和VSV-NJ,两者没有交叉反应现象,对其他几种相似病原的灭活抗原,如口蹄疫病毒(FMDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等检测均呈阴性。对10倍系列稀释的水疱性口炎灭活病毒液的检测敏感性可达10-5,与传统的荧光定量PCR的检测敏感性相当。该方法无需提取核酸,可在2h内完成对样品的检测,结果准确、快速、灵敏,为印第安纳型和新泽西型水疱性口炎病毒的特异性鉴别提供了一种切实可行的方法。

猪水疱病病毒研究进展

猪水疱病是猪的一种急性传染病,与口蹄疫和水疱性口炎等水疱类疫病具有同等的重要性,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疾病。文章主要介绍了本病病原近年来在分子生物学方面的研究概况,主要包括RNA基因组的结构和功能的研究、结构蛋白功能的新发现、抗原结构的研究、病毒的诊断研究以及与柯萨奇病毒B5的关系等方面的研究现状。

猪水疱病病毒外壳蛋白的二级结构和抗原表位预测

以SVDV外壳蛋白基因序列为基础,采用Chou-Fasman法、Garnier-Robson法和KarplusSchulz法预测蛋白质的二级结构。按KyteDoolittle方案、Emini方案和JamesonWolf方案预测SVDV外壳蛋白的B细胞表位。预测结果表明,SVDV外壳蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的转角和无规则卷曲等柔性区域以及α螺旋和β折叠区段;SVDV外壳蛋白的VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞优势表位,其中VP1蛋白的B细胞表位优势区域比VP2和VP3蛋白的多,与已鉴定的B细胞表位相比较,该方法预测的结果有较高的准确度。为实验确定SVDV外壳蛋白的B细胞表位和反向疫苗学设计提供了理论基础。

水疱性口炎病毒研究概述

对水疱性口炎病毒的病原特征、临床症状、流行病学、病毒的致病和免疫机制进行了概述,并对其作为载体在重组疫苗上的研究热点进行了展望。

水疱性口炎病毒糖蛋白基因的克隆和表达

对一株实验室保存多年的水疱性口炎病毒(VSV)的囊膜糖蛋白(VSV_G)基因进行了克隆和测序,并且构建了重组VSV_G真核系统表达载体。结果表明克隆的VSV_G基因全长1536个核苷酸(nt),其编码的G蛋白长为511个氨基酸(aa),氨基酸序列与20个Indiana血清型VSV毒株的同源性在95.4%左右(94.1%～98.0%)。种系发生树分析表明此病毒株属于水疱病毒属的VSV_Indiana血清型。经免疫荧光检测证明构建的重组VSV_G表达质粒pCIVG5和pCRVG6转染23T细胞后能够有效地转录和表达,这为进一步开发利用VSV_G奠定了基础。

水疱性口炎病毒RT-LAMP快速检测方法的研究

根据逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)原理,针对水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G基因序列中的6个区域设计内外各1对特异引物,建立扩增VSV糖蛋白(G)基因的RT-LAMP方法。扩增产物电泳呈特异的阶梯状条带分布,扩增产物加SYBR GREEN I染色呈特征性的黄绿色,肉眼可直接观察判定。同时,还建立了可以进行定量检测的实时RT-LAMP方法。特异性试验显示,本方法可快速检验鉴别VSV与口蹄疫病毒(FMDV)和猪水泡病病毒(SVDV)。敏感性试验显示,建立的实时RT-LAMP方法检测VSVRNA的最低检测量为0.01 PFU,比实时荧光RT-PCR显著提高。建立的LAMP方法可检测p-VSVNJ质粒DNA的最低量为6.36×10-3pg/μL(1.4×103copies/μL),比PCR也显著提高。综合表明,本研究建立RT-LAMP检测VSV的方法具有特异、敏感、快速、简便的特点,具有开发应用前景。

水疱性口炎病毒糖蛋白的原核表达及间接ELISA诊断技术的试验

本研究利用重组质粒p ET-32a-NJ-G666(针对新泽西型水疱性口炎病毒截断的G蛋白基因片段约666 bp),将其转化至Rosetta宿主菌,用0.6 mmol/L IPTG在30℃诱导4 h,经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,表达的重组蛋白分子质量与预期的30 k Da相符。在此基础上,利用纯化的重组蛋白作为抗原包被酶标板,建立了可检测新泽西型VSV抗体的间接ELISA方法。该方法检测东部马脑脊髓炎和马西尼罗病毒的阳性血清均为阴性,且板内和板间变异系数均小于10%。试验结果表明,建立的间接ELISA方法特异性强、重复性好,为新泽西型VSV血清抗体的检测提供了依据。