利用反义基因沉默策略构建水稻突变体库及突变体筛选

尝试利用鸟枪反义基因沉默策略构建水稻突变体库.利用水稻反义cDNA文库转化粳稻品种中花11,获得了来源于105块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织的1486个转化植株.随机选择来源于11个独立转化系的335个T0植株进行Hm离体叶片筛选,结果表明所有植株均呈抗性,并且与PCR检测结果相吻合,说明T0植株中不存在假转化体.Southernblot分析结果表明T0植株大部分为单位点整合.T0及T1代转化植株均呈现了一些形态变异,如矮化、无分蘖或多分蘖、结实率降低、粒型或穗型改变、小穗结构改变等.利用Hm离体叶片筛选法对部分T1群体进行筛选,得到了1个变异性状与Hm抗性共分离的突变体,该突变体的变异表型为结实率比非转化对照下降约50%,每穗颖花总数比对照减少约40%,二者的总效应导致突变体单穗产量比对照约下降70%.

水稻突变体Shuanglimi的光合特性

以水稻突变体Shuanglimi为试验材料,对其幼穗处于减数分裂期时剑叶的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、叶片气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、水分利用率(WUE)和羧化效率(CE)、叶绿素含量及剑叶中维管束数目进行了测定和观察。结果表明,Shuanglimi的Pn、WUE和CE较CK分别降低了(71.18±2.08)%,(72.00±2.51)%和(79.33±3.27)%(P<0.01),而其Tr和Ci与CK之间无显著差异。Shuanglimi总叶绿素含量较CK降低,尤其是叶绿素b含量大幅降低。同时,Shuanglimi剑叶中小维管束的数目较CK降低了(18.86±1.97)%(P<0.01),而大维管束中含有3个和4个导管的特异变化数目较CK明显增加。由此可见,Shuanglimi的光合特性差异是其子粒和生殖特性差异形成的原因之一。

基因捕获技术及其在水稻突变体库构建上的应用

基因捕获是一种新的基因标签技术,被广泛应用于植物突变体库的构建及基因分离。近年来,基因捕获技术应用于水稻突变体库构建方面取得了显著进展;介绍了基因捕获技术及其在水稻突变体库构建上的应用。

水稻突变体des2和des5的研究和定位(英文)

小穗发育是决定水稻产量的主要农艺性状,鉴定控制小穗发育的关键基因对研究和分析调控农艺性状的分子机理是至关重要的。本文中,我们鉴定了一组小穗数目明显减少的突变体,命名为decreased spikelets(des),这里详细研究des2和des5两个突变体。结果显示des2是由单基因隐性位点控制,图位克隆将此位点定位到6号染色体的长臂上,并最终克隆了此基因,发现des2是moc1的一个新的等位突变体。定位克隆和序列分析显示在des5中,LAX基因的编码HLH(螺旋-环-螺旋)结构域的区域发生了一个点突变,暗示des5是lax的一个新的等位突变体。我们的结果暗示小穗和水稻叶腋分枝的发育受相同的遗传途径调控。

γ射线辐射诱导水稻突变体的基因组变异分析

辐射诱变技术广泛应用于水稻种质资源创新。为了明确辐射诱导突变的分子机制,采用二代高通量测序技术对水稻品种黄华占经辐射诱导获得的一个突变体湘辐1821进行全基因组变异分析。与参考序列蜀恢R498相比,在黄华占和湘辐1821中分别检测到758215和799434个单核苷酸多态性位点(SNPs),142313和147686个插入缺失(InDels),16775和18382个结构变异(SVs)以及16614和17658个拷贝数变异(CNVs)。黄华占和湘辐1821的SNPs转换与颠换的比率约为2.5,这两种基因型SNPs以转换为主要类型。在黄华占和湘辐1821的InDels中短序列InDels远多于长序列,说明点突变为主要突变方式。拷贝数减少是黄华占和湘辐1821的主要拷贝数变异方式。同时对黄华占和湘辐1821重测序数据整合差异比较分析,两种基因型的差异SNPs有86163个,InDels有88777个。对差异SNPs位点所在基因进行基因本体(GO)分析,3092个候选基因中70%位于生物学过程中,该研究结果将对湘辐1821表型分析具有重要参考意义,同时为辐射诱导突变机制提供新的见解。

水稻T-DNA插入突变体库中Rubisco抗氧化胁迫株系的筛选

以水稻(Oryza sativaL.subsp.japonica)品种"中花11"构建的T-DNA插入突变体库为材料,用甲基紫精诱导叶绿体产生活性氧,通过SDS-PAGE电泳分析Rubisco含量相对于野生型的变化,筛选耐氧化胁迫的株系。结果表明,与对照相比,突变体材料各个株系叶片中的Rubisco小亚基的相对含量有较大差异,说明这种筛选Rubisco突变体的方法是可行的,且从中找到了两株Rubisco耐氧化胁迫的株系。

CRISPR/Cas9系统构建的水稻OsPht基因突变体材料可用于养分转运评价

【目的】CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为免受外来DNA片段侵袭形成的一种适应性免疫系统。CRISPR/Cas9已经被作为一种基因编辑的工具广泛应用到很多动物和植物的基因编辑。磷元素是植物生长过程中必需的营养元素,植物对磷的吸收主要由跨膜磷转运蛋白完成。本研究利用CRISPR/Cas9技术对OryzaJaponicaKitaake水稻中冰叶日中花磷转运蛋白McPht基因的同源体OsPht磷转运蛋白基因进行编辑,构建了McPht转运蛋白基因导入水稻OsPht缺失的突变体,初步验证了该突变体材料的功能。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑手段,将水稻中与McPht蛋白同源性最高的磷转运蛋白基因进行编辑。首先将待编辑的基因片段连接到U3启动子驱动的pCXUN表达载体上,转化到农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌转化到水稻幼胚,将获得的转化后再生T0代株系移栽到田间获得T1代种子,并将T1代株系进行盆栽培养,提取株系叶片基因组DNA用于PCR检测,所有株系PCR产物纯化后进行测序,依据序列变化判定目标基因的编辑位点,并对突变体进行生理指标测定。【结果】1)基因编辑后的类型可分为两类,一类为目标编辑片段20个碱基中后6个碱基缺失,另一类为目标编辑片段20个碱基中后8个碱基缺失或突变。2)编辑位点缺失6个碱基的株系占总突变株系的28.6%,编辑位点缺失8个碱基的株系占总突变株系的42.9%,GT碱基突变株系占总突变株系的28.6%。3)水稻突变体的株高、鲜重、根系活力均小于野生型;根系扫描结果显示水稻突变体的根长、投影面积、表面积和侧根数均大于野生型;Cas-2的叶绿素和可溶性糖含量显著高于野生型,Cas-7的叶绿素和可溶性糖含量小于野生型,但差异不显著。【结论】CRISPR/Cas9基因编辑系统成功将水稻中McPht的同源体OsPht基因进行了编辑,所获得的水稻磷转运蛋白OsPht基因碱基缺失或突变不仅为所编辑基因的功能研究提供有效的科学依据,同时为冰叶日中花McPht磷转运蛋白基因导入OsPht基因功能缺失的水稻株系、验证其生理生化功能提供宝贵的评价材料支持。本研究表明基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统在功能性评价植物养分转运蛋白基因方面是一条有效的途径。

野生型水稻及其低硅突变体中植硅体和植硅体碳的含量与分布特征

【目的】水稻是典型的富硅植物,植硅体沉积在水稻体内可封存有机碳。本文分析不同吸硅能力基因型水稻植硅体含量、形态、分布及其固碳特征,探究水稻植硅体固碳机理。【方法】盆栽试验在浙江大学玻璃房内进行。供试材料为水稻低硅突变体Lsi1和Lsi2及其野生型,所有施肥和管理措施一致。于成熟期,取水稻地上部茎、叶、鞘样品,常规方法测定硅、植硅体、植硅体碳含量。【结果】1)不同基因型水稻体内硅含量、植硅体含量、生物量干物质植硅体碳含量存在显著差异,均表现为突变体显著低于其野生型,大小依次为Lsi1野生型> Lsi2野生型> Lsi2突变体> Lsi1突变体,Lsi1和Lsi2突变体水稻植硅体碳含量显著高于其野生型,大小依次为Lsi1突变体> Lsi2突变体> Lsi2野生型> Lsi1野生型。2)野生型水稻硅与植硅体含量为鞘>叶>茎,而突变体水稻硅与植硅体含量为叶>鞘>茎,水稻叶片中的植硅体碳与生物量干物质植硅体碳含量最高,植硅体碳含量整体分布趋势为叶>茎>鞘,生物量干物质植硅体碳含量整体变化趋势为叶>鞘>茎。3)水稻植硅体含量与硅含量之间呈极显著正相关(P <0.01),高吸硅的水稻植硅体含量高,且形成的植硅体比表面积小,表明植硅体含量及其形态受其遗传特性的影响。植硅体含量与生物量干物质植硅体碳含量之间呈极显著正相关(P <0.01),植硅体碳含量与生物量干物质植硅体碳含量之间呈极显著负相关(P <0.01),表明生物量干物质植硅体碳含量除了受植硅体含量影响,还受植硅体所包裹的有机碳浓度影响。4) Lsi1及Lsi2野生型水稻生物量、植硅体储量、植硅体碳储量显著高于其突变体。【结论】具有高吸硅能力的野生型水稻与其突变体相比,生物量、硅、植硅体、生物量干物质植硅体碳含量增加,分布不同,虽然植硅体碳含量降低,但植硅体碳储量增加。Lsi1及Lsi2野生型水稻比低硅突变体水稻具有更高的固碳潜力。

水稻淡黄叶突变体标810S不同叶位光合特性研究

以温敏核不育系810S为对照，对810S的淡黄叶突变体标810S叶绿素含量、净光合速率、暗呼吸速率和生物产量进行了比较研究．结果表明：淡黄叶突变体标810S各叶位叶绿素含量均比对照810S低，其光合色素含量的变化幅度为对照的60．9％～50．4％，但标810S各叶位净光合速率比对照高，增加幅度为4—5μmol·m^-2·s^-1．各发育时期的暗呼吸速率标810S比对照高0．23—0．35μmol·m^-2·s^-1，株高和生物学产量与810S接近．

水稻白条叶突变体(st10)的遗传分析与基因定位

在水稻甲基磺酸乙酯(Ethylmethane Sulphonate,EMS)诱变突变体库中,发现了一个以粳稻品种日本晴(Nipponbare)为背景的白条叶突变体,该突变体叶片在2-3叶期出现纵向白条的突变性状,此后随着植株的生长逐渐弱化,至抽穗期叶片颜色基本恢复正常,只有叶脉仍呈白色。白条性状受温度影响,高温时性状明显,所有突变个体出现白穗现象。低温条件下,白条较窄,颜色不明显,穗的颜色正常。以培矮64s为母本,突变体st10为父本构建分离群体,遗传分析结果表明该突变性状由一对单隐性核基因控制。利用F2分离群体中突变型植株将目的基因定位在第3染色体短臂上STR19和STR24两个分子标记之间150kb的范围内。本实验测定了24℃、28℃和32℃三个温度条件下的叶绿素含量,发现突变体st10在32℃条件下叶绿素a和叶绿素b的含量减少,28℃、24℃条件下变化不明显。叶绿素荧光数据分析结果显示白条叶突变体的最大量子产额低于野生型。

水稻少侧根突变体MT10的双向电泳分析

用双向电泳技术分析水稻少侧根突变系MT10及其野生型IR8的根系全蛋白质组,建立二者间的差异表达图谱,得到了11个差异点,其中只在MT10中表达的蛋白点有2个,只在IR8中表达的蛋白点有4个,两者间有明显差异的蛋白点有5个。

水稻叶色突变体的高光合特性

标810S是温敏核不育系810S中的淡黄绿叶自然突变株,具有较高的光合速率。本文对突变体的光合色素、光合速率、荧光参数和光合关键酶活性等研究发现,标810S光合色素约为810S的一半,强光条件下标810S光合速率(Pn)比对照高,且没有明显的"午休"现象。标810S气孔导度(Gs)显著增加,叶绿素荧光动力学参数显示,标810S光量子转化效率高;光合酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)活性是对照的69.80%,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)和NADP-苹果酸酶(NADH-ME)却比810S分别上升79.50%和69.06%。研究结果认为,光合色素含量下降是标810S叶片呈淡黄绿叶色的根本原因。突变体通过减少热耗散和提高光合电子传递速率来提高光能利用效率,为暗反应提供足够的同化力,而较高的PEPC活性和较大的气孔导度使其能更有效地固定CO2,光反应和暗反应的协同使突变体具有较高的光合速率。

水稻叶色突变体研究进展

从水稻叶色突变体的产生方法、类型、遗传规律及突变基因的定位与克隆、叶色突变表型的光温调控和分子机理等方面系统综述了水稻叶色突变体的研究进展,并对叶色突变体的应用前景做了进一步分析,旨在为深入研究水稻叶色突变体提供参考。

水稻空间诱变雄性不育突变体ws-3-1的抑制缩减杂交分析

为了解空间诱变产生的水稻核雄性不育突变体ws-3-1基因表达的特点,对ws-3-1和原种特籼占13减数分裂二分体时期的cDNA进行了抑制缩减杂交(SSH)分析,分别从正向和反向缩减文库中检测到109和104个表达有差异的克隆.对这些克隆进行了测序和同源性分析,并利用Northern杂交技术,从中鉴定出5个在原种与突变体间减数分裂二分体时期表达有差异的基因,并分析了该雄性不育突变体基因表达的变化与表型的关系.

水稻叶色突变体812HS蛋白质复合物和叶绿素合成特性的研究

以水稻叶色突变体812HS与野生型812S为材料,利用蓝绿温和胶电泳技术和生理方法对叶尖端类囊体膜蛋白质复合物含量以及叶绿素合成前体物质进行了比较。结果表明,和野生型812S相比,水稻叶色突变体812HS在分蘖盛期叶绿素含量开始明显减少,叶绿素a/叶绿素b比值增加,突变体的类囊体膜蛋白质复合物如光系统Ⅱ捕光色素蛋白(LHCⅡ)含量、光系统Ⅰ核心复合体(PSⅠcore)含量和F1-ATP合酶复合体和细胞色素b6/f复合体(F1-ATPase&Cy tb6/f)含量显著减少。突变体812HS叶片叶绿素合成代谢中间产物5-氨基酮戊酸(ALA)、胆色素原(PBG)、尿卟啉原Ⅲ(UrogenⅢ)含量均显著高于野生型812S,而原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)、镁原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)、原脱植基叶绿素(Pchlide)、Chla、Chlb含量却显著低于野生型812S。即水稻叶色突变体812HS的叶绿素含量明显减少,一方面是由于囊体膜蛋白质复合物的减少影响了其对光的吸收和传递;另一方面通过测定叶绿素合成的前体物质初步认为是由于叶绿素合成过程中UrogenⅢ到ProtoⅨ合成过程受阻所致。

水稻斑点叶突变体spl101和spl102的筛选及候选基因鉴定

斑点叶突变体是指植物在正常生长条件下叶片或叶鞘上自发形成、且与病原菌侵染产生的病斑类似的一类突变体,筛选并研究斑点叶突变体对揭示植物抗病反应机理具有重要意义。为了进一步研究斑点叶的形成机制,本文通过EMS诱变品种宽叶粳(KYJ),筛选得到两个斑点叶突变体spl101和spl102。这两个突变体在生长发育晚期(抽穗期以后)形成严重的类病斑。遗传分析表明,spl101和spl102均受隐性单基因控制。利用Mutmap方法对候选基因进行克隆,结果显示,spl101和spl102的候选基因均为OsEDR1,该基因与类病斑发生有关。在spl101中,OsEDR1基因突变发生在第6外显子和第6内含子的交接处,该突变导致第6内含子的错误识别,最终造成移码突变。在spl102中,OsEDR1基因突变发生在第10外显子上,导致一个苯丙氨酸(F)变成半胖氨酸(C)。因此,本研究鉴定了两个新的OsEDR1等位突变,对OsEDR1抗病反应机理的进一步研究及丰富水稻种质资源具有积极意义。同时验证了利用Mutmap方法克隆水稻突变基因的有效性。

水稻脆性突变体nbc(t)的主要特性和脆性基因的初步定位

对脆性突变体的表型、主要农艺性状和稻米品质进行了考查,并对脆性基因进行了初步定位。结果表明:脆茎水稻nbc(t)与野生亲本9311在株高等形态特征上无明显区别,仅在机械强度上有区别;nbc(t)的根、茎、叶、穗及种子都很脆,易折断,且表现全生育期脆性。脆茎突变体nbc(t)的主要农艺性状与9311相似,产量略低于9311,除了整精米率偏低以外,其他稻米品质性状与9311相似。脆茎突变体nbc(t)与广占63-4S所配组合的产量和稻米品质与扬两优6号相当。与9311相比,nbc(t)茎秆的抗折力相当,但抗张力明显降低,纤维素含量约降低17%。遗传分析表明,nbc(t)的脆茎特性可能由2个基因位点控制,初步定位在9号染色体上的2个区段,一个位于9号染色体上段SSR标记RM3700和RM24371之间,遗传距离分别为1.3cM和3.1cM;另一个位于9号染色体下段INDEL标记CL062和CL045外侧,遗传距离分别为1.6cM和6.0cM。

空间搭载诱导水稻种子突变的分子标记多态性分析

以卫星空间搭载广东水稻品种特籼占13干种子,返地种植后经5代选择、培育,获得一批形态及育性变异的突变体及品系(种),如株高变矮,稻穗变大,雄性不育等。为了探索空间诱变的本质,对选出的6个突变体及2个优良品系,选用了130个10-mer随机扩增多态性DNA(RAPD)引物和17对扩增片段长度多态性(AFLP)引物组合,分别对其基因组DNA进行多态性位点扫描分析,两种方法的结果均显示:不同的突变体与原种DNA之间存在不同程度的多态性差异,且由两法得到的结果较接近,为6%-12%。此结果从分子水平上进一步证明了空间环境确实对植物种子存在诱变作用。

一种水稻白苗突变体在杂交种子纯度鉴定中的利用价值研究

在水稻花培后代中发现一种苗期叶片白化而成株转绿型突变体,将该突变性状转入温敏不育系培矮64S中育成白02S.本研究观察这一不育株系的叶色形态表现及育性稳定性,并测定了叶绿素含量变化规律.结果表明,不同生态条件下,该株系苗期叶片明显白化且表现稳定,一定叶龄后新出叶恢复正常绿色,成株生长与正常水稻无差别.白02S与正常叶植株杂交,F1表现正常绿色.研究认为该性状可作为一种形态标记性状应用于水稻杂交种子和不育系纯度的苗期快速检测鉴定.