立枯丝核菌Rhi-milR9829-5p与水稻和大豆互作的分子机理

立枯丝核菌可侵染水稻、大豆等260多种植物,是作物生产中的主要真菌性病害致病菌之一。microRNA(miRNA)是一类由20~25个核苷酸组成的非编码RNA分子,可以通过降解mRNA或抑制mRNA的翻译从而在转录或翻译水平上负调控靶基因的表达。已有研究表明,miRNA参与了真菌与植物互作等多种生物学过程。在前期研究中,课题组鉴定到一个能够负调控玉米抗病性的立枯丝核菌Rhi-milR9829-5p,为了进一步研究其在不同作物中的致病功能和机理,本研究获得了Rhi-milR9829-5p成熟体过量表达的水稻转基因植株,对阳性T1代植株接种立枯丝核菌后发现,Rhi-milR9829-5p过量表达的水稻植株对纹枯病的抗性显著降低。利用生物信息学方法分别预测了Rhi-milR9829-5p在水稻和大豆中的下游靶基因并进行功能注释分析,结果表明Rhi-milR9829-5p通过多种生物学途径调控水稻和大豆的抗病性,且在水稻和大豆中存在明显不同。研究结果初步揭示了立枯丝核菌Rhi-milR9829-5p调控水稻和大豆抗病性的分子机理,进一步验证了miRNA的跨物种调控功能,为作物抗病分子育种提供了基因资源。

萎缩芽胞杆菌LB6-2抑制立枯丝核菌活性物质的鉴定

本研究采用平板对峙法、菌丝生长速率法和菌核萌发抑制法筛选出一株细菌LB6-2,对立枯丝核菌的菌丝生长抑制率为71.76%,菌核萌发抑制率为100.00%。通过观察形态学特征、分析理化性质结合16S r DNA扩增序列分析对该菌株鉴定为萎缩芽胞杆菌Bacillusatrophaeus(OK639005.1)。采用大孔树脂法提取发酵产物并进行HPLC制备,对获得的14个组分进行活性测定确定其活性组分,从活性组分中制备获得3个单品化合物LBN4-2、LBN4-4、LBN4-5,经HPLC-MS、NMR分析和活性测定结果表明,化合物LBN4-2为Cyclo(Pro-Val)、LBN4-4为Cyclo(D-Leu-L-Pro)和LBN4-5为Cyclo(L-prolyl-D-phenylalanyl),3个化合物的浓度在4 mmol/L时对立枯丝核菌菌丝生长的抑制率分别为86.16%、84.87%和83.10%,浓度在2 mmol/L以上时,对立枯丝核菌菌核萌发的抑制率为100%。由此可见,萎缩芽胞杆菌LB6-2具有作为防治立枯丝核菌生防菌剂研发的潜力。

立枯丝核菌拮抗菌枯草芽孢杆菌ATCC 6051发酵条件优化及抑菌物质分析

立枯病是一种由立枯丝核菌(Thanatephorus)引起的重要土传病害,其寄主范围广且多发生于苗期,严重时可导致整株幼苗枯萎死亡,造成重大经济损失。为探究枯草芽孢杆菌对立枯病的生防机理,本研究以枯草芽孢杆菌ATCC 6051发酵液对立枯丝核菌丝抑制率为评价指标,通过单因素试验和响应面法对枯草芽孢杆菌的培养基配方和发酵条件进行优化,同时利用antiSMASH对其全基因组进行次级代谢产物预测分析。结果表明,最佳培养基组合和发酵条件为柠檬酸2.0%、蛋白胨2.5%、硫酸钾2.4%、接种量5%、发酵时间37.7 h,在此条件下抑菌率从27.32%提高至52.57%。次级代谢产物预测分析显示,该菌株具有编码7种肽类和3种抗生素类抑菌物质的基因簇。综上,优化后的培养条件可有效提高枯草芽孢杆菌对立枯丝核菌的抑菌效率,其主要抑菌活性物质可能是肽类化合物。本研究结果为揭示枯草芽孢杆菌ATCC 6051抑菌机制及立枯病生物防治提供了有价值的参考。

四川省水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的遗传分化与致病力

通过对四川省东、南、西、北、中5个区域、55个县(市)水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)样本进行分离、纯化和菌丝融合鉴定,发现分离得到的55株立枯丝核菌菌株除了D42菌株外,其余均属于AG-1IA群。还发现其中一些菌株同时能与多个群发生融合,具有桥梁菌群属性。通过离体叶片致病力鉴定发现,各菌株间致病力差异显著。进一步的RAPD聚类分析显示,在相似系数为0.941处,该55株菌株可聚为8类。这一结果表明,在四川特殊的生态区条件下,四川省水稻立枯丝核菌大多数菌株保持了良好的遗传一致性,但少数菌株发生了较大程度的变异。

戊唑醇对立枯丝核菌的抑制作用及在水稻上的应用

戊唑醇是一种高效、广谱、内吸性强的三唑类杀菌剂。研究表明,在离体条件下其对立枯丝核菌Rhizoctonia solaniKuhn菌丝生长具有很强的抑制作用,EC50值为0.509μg/mL。无论在天然培养基(LBA)还是在半组合培养基(AEA)上,戊唑醇均会抑制菌核的产生,且菌核的产量随着药剂浓度的增加而降低;虽然其对菌核的萌发无影响,但对菌核萌发后菌丝的生长有强烈的抑制作用。温室试验结果表明,立枯丝核菌菌碟经戊唑醇处理后,其对分蘖期水稻植株的致病力随着药剂浓度的提高而下降;戊唑醇可很好地被水稻叶片和根系吸收,并输送到水稻的茎部;对水稻纹枯病具有保护和治疗作用,EC50值分别为58.03和62.53μg/mL;对立枯丝核具有较长的持效期,800μg/mL处理水稻7d后再接种的防效为41.46%。田间药效试验表明,43%的戊唑醇悬浮剂在有效剂量116.10g/hm2下两次喷药后15d的防效达71.97%。该药剂在本试验剂量范围内对水稻安全。

两种杀菌剂对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)生长的抑制作用机理

为探究代森锰锌和多菌灵两种杀菌剂对引起苗木立枯病的一类病原菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani J.G.Kühn)的抑菌机理,采用菌物学和生物化学等方法,研究代森锰锌和多菌灵对立枯丝核菌的抑制作用,测定两种杀菌剂对立枯丝核菌的毒力作用,分析抑菌率进而计算出对于该菌的抑菌中浓度(EC_(50)),并从菌株生长和生理代谢两个侧面探讨立枯丝核菌对杀菌剂胁迫的响应。结果表明:代森锰锌的抑菌效果要好于多菌灵,其平均抑菌率最大可以达到90%,根据抑菌回归方程求得代森锰锌EC_(50)浓度为10.23mg·L^(-1),多菌灵EC_(50)浓度为2213.77mg·L^(-1)。在菌株生长方面,两种杀菌剂均能抑制立枯丝核菌的生长。在生理代谢方面,菌株生长必需的碳和磷元素的利用被抑制,PCA分析表明,杀菌剂主要通过抑制菌株营养利用(碳和磷)达到杀菌目的。除此之外,采用药剂抑菌中浓度浸泡方法,利用抑菌中浓度药剂对菌株进行浸泡,研究菌株在药剂胁迫下的抗氧化酶活性和细胞渗透调节物质的含量变化。结果表明:杀菌剂处理组,菌株细胞的渗透调节物质(可溶性蛋白和丙二醛)、抗氧化酶活力(CAT、POD和SOD)均有不同程度的上升,表明菌体受到不同程度的破坏,其中代森锰锌对菌体的胁迫程度要高于多菌灵。综合以上试验结果分析,这可能是代森锰锌和多菌灵对立枯丝核菌(R.solani)的杀菌机理,该结果可为科学防治苗木立枯病提供参考。

四川棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)菌丝融合群研究

从四川棉区采集棉花立枯病标样，分离得到６９９个分离物，从中鉴定出４１４个丝核菌（Ｒｈｉｚｏｔｏｎｉａｓｐｐ）菌株，经Ｇｉｅｍｓａ核相染色，鉴定出４０９个菌株属多核丝核菌（ＭｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｐｐ），占丝核菌总数的９８．８％。另５个菌株属双核丝核菌，占总数的１．２％。用载片定位融合法，以生越明（１９９２）提供的国际标准菌测定，４０９个多核丝核菌分属三个菌丝融合群，即ＡＧ－１、ＡＧ－２和ＡＧ－４，其中ＡＧ－４出现比率占多核丝核菌总数的７９％，是四川棉苗立枯丝核菌的代表菌。室内、外致病力测定结果，以ＡＧ－４融合群对棉花的致病力最强，ＡＧ－１融合群居中，ＡＧ－２融合群最弱，三者室内与田间平均病指数分别为９５．９、５７．６和３６．２。

棘孢木霉对水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌生物防治的研究

为了检测棘孢木霉T12对立枯丝核菌的生防效果,测定了T12对立枯丝核菌RS02菌株竞争性抑制作用,T12挥发性代谢物对RS02菌核萌发和菌丝生长的影响,T12的发酵液对RS02菌核萌发、菌丝干质量和侵染相关酶活力的影响。结果显示,培养4d的T12通过空间竞争对RS02生长产生抑制,抑制率达78.7%;T12产生的挥发性物质对菌核萌发和菌丝生长抑制率分别为10.3%、12.2%;大于10%浓度T12发酵液对菌核萌发、菌丝干质量均表现出显著或明显的抑制效果,50%浓度发酵液对菌核萌发、菌丝干质量的抑制率分别为65.7%、88.2%;培养5 d,10%、30%、50%浓度发酵液处理的RS02纤维素酶活力分别降低了17.4%、55.0%、76.8%,果胶酶活力分别降低了21.8%、53.9、69.5%。综合试验结果可知,棘孢木霉T12能够显著抑制立枯丝核菌的生长并降低其侵染能力。

水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达及序列分析

根据Thanatephorus cucumeris G蛋白β亚基序列(AY884129)设计引物,对水稻立枯丝核菌AG-1IA的G蛋白β亚基基因进行了克隆。PCR结果得到1条约为1.9kb的扩增片段,包含1个约1.7kb的完整开放阅读框,编码366个氨基酸。同源性检索发现该序列与大量G蛋白β亚基基因明显同源,一致性介于57.34%～88.14%。根据其推导cDNA序列设计引物进行RT-PCR分析,发现该基因在对数生长期表达量最高,提示水稻立枯丝核菌AG-1IAG蛋白β亚基基因可能具有时空表达特性。

水稻纹枯病立枯丝核菌的分类及遗传多样性研究进展

水稻纹枯病是一种世界性病害,目前该病已成为限制水稻高产、稳产的主要障碍之一。本文简述了引起水稻纹枯病的病原菌立枯丝核菌的形态特征,概述了依据菌丝形态特征和融合群进行分类的概况,阐述了同工酶、RAPDI、SSR和AFLP等分子生物学技术在水稻纹枯病菌遗传多样性研究中的应用。

浙江省水稻立枯丝核菌5.8S rDNA-ITS区间多样性

对浙江省82个水稻立枯丝核菌菌株及13个标准融合群菌株5.8S rDNA-ITS(ITS)区间测序和分析,结果表明,ITS在标准融合群菌株间的差异远大于AG1-IA融合群的水稻菌株间的差异,进化分析表明,ITS的差异可以有效甄别不同标准融合群菌株,但对AG1-IA融合群的水稻菌株区分能力非常有限。单倍型分析表明,这82个水稻菌株可以分为10个单倍型。田间菌株的单倍型多样性(Hd)为0.208 7,核苷酸多样性为0.000 33。其中单倍型H1为优势单倍型,占全部菌株的87.8%,而其他9个单倍型则各只有1株菌株。中性检验结果表明Tajima's D测验值为-2.260 12(P<0.01),Fu和Li's D测验值为-5.208 27(P<0.02),暗示浙江省水稻纹枯菌菌株显著偏离中性假说,在历史上可能出现过种群扩张,并存在很强的选择作用。

立枯丝核菌对水稻侵染过程的研究

用立枯丝核菌(Rhizoctonia solani kuhn)的二个菌丝融合群AG—1IA及AG—4,对三个水稻品种的接种试验表明,二融合群菌株对水稻的侵染过程有一些相似,但是它们在侵染结构的产生和侵入的方式上不完全相同。AG—1IA从侵染垫及裂片状附着胞上形成侵染钉侵染水稻,AG—4除了在下位叶鞘上有较少的侵染垫和附着胞之外,在其它部份的材料上以菌丝直接穿透水稻表皮或从气孔侵入。根据试验认为,侵染结构的形成,不仅与菌株致病力的水平有关系,也与水稻的不同部位对纹枯病抗病能力的差异有关联。

水稻—油菜轮作土壤拮抗立枯丝核菌的筛选和鉴定

【目的】水稻—油菜轮作是防治土传病害的重要栽培管理措施。为了分离筛选出轮作土壤中对立枯丝核菌产生拮抗作用的细菌。【方法】通过对已确定出的病原真菌立枯丝核菌进行平板培养和拮抗试验。应用平板对峙法将水稻-油菜轮作土壤分离出的菌株接种至含立枯丝核菌的平板中培养筛分拮抗菌株,并对具有拮抗作用的菌株进行生理生化试验和16S rDNA序列分析。【结果】从长期水稻—油菜轮作实验田土壤中筛分出77株细菌,试验发现四株分离菌株具有明显拮抗立枯丝核菌的作用。应用现代分子生物学技术和微生物生理生化鉴定方法对拮抗立枯丝核菌进行鉴定,鉴定结果发现两株拮抗菌株为弯曲芽胞杆菌(Bacillus flexus),另两株为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。【结论】研究结果为揭示水稻-油菜轮作下土壤微生物防治土传病害机制及功能微生物菌株的拮抗效应与潜力提供了科学依据。

产色链霉菌(Streptomyceschromogenes)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)转化NO_3^-的研究

筛选出２株真菌，产色链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｈｒｏｍ ｏｇｅｎｅｓ）和立枯丝核菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）具有转化ＮＯ－３ 的活性⒚它们的活性甚至比枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）还强⒚产色链霉菌和立枯丝核菌将ＮＨ＋４ 转化为ＮＯ－３ 的机理也不同于真菌尖孢镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｉｕｍ ）必需有ＮＯ－３ 或ＮＯ－２ 的诱导才具有活性，它们可直接将硫酸铵转化为ＮＯ－３ ，进而再将ＮＯ－３ 转化为ＮＯ－２

噻呋酰胺对水稻立枯丝核菌群体的活性变化及其对稻田天敌群落的影响

分别从未使用过噻呋酰胺及使用噻呋酰胺3年以上的浙江省稻田采集分离立枯丝核菌Rhizoctonia solani,通过监测、分析病原菌群体对噻呋酰胺的敏感性变化,研究了立枯丝核菌对噻呋酰胺的抗药性风险;并以戊唑醇、井冈霉素等纹枯病防治常用药剂为对照,通过田间试验评价了噻呋酰胺油悬浮剂(OD)对稻田天敌群落的影响。结果表明:浙江省未接触过噻呋酰胺的立枯丝核菌群体(n=164)的EC50值分布在0.008~0.135 mg/L之间,且呈近似正态单峰曲线,平均EC50值为(0.073±0.005) mg/L,可作为立枯丝核菌对噻呋酰胺的敏感性基线,用于后续田间抗药性监测。接触过噻呋酰胺3年以上的立枯丝核菌群体(n=130)的EC50值分布在0.009~0.126 mg/L之间,平均EC50值为(0.069±0.080) mg/L,未观察到明显的敏感性下降。对稻田天敌群落影响的田间试验表明,采用12%噻呋酰胺油OD处理7 d后,绍兴稻田的Shannon多样性指数和丰富度指数均显著高于清水对照(CK),而其他时间和地点均与CK无显著性差异。研究表明,采用噻呋酰胺防治水稻纹枯病的田间抗药性风险低,对稻田天敌安全性高。

荞麦立枯丝核菌抗性分子机制获解析

中国农业科学院作物科学研究所特色农作物优异种质资源发掘与创新利用团队揭示了茉莉酸诱导的黄酮类物质参与调控苦荞立枯丝核菌抗性的分子机制。相关研究成果在线发表于《植物细胞》上。

水稻生育期对立枯丝核菌的反应研究

在自然条件下分期播种,同时接种和在温室温湿度基本一致的条件下,对六个水稻品种的分蘖、拔节和抽穗三个生育期人工接种测定水稻的不同生育期对立枯丝核菌的反应.结果表明:供试品种中无免疫和高抗的,但对丝核菌不同融合群反应不同,对AG—4的反应差异不显著,对AG—1IA植株发病程度有一些差异;其中三个发病较轻的品种各生育期对病菌的反应无明显差异,另三个发病较重的品种在分蘖期、拔节期比抽穗期发病稍轻。因此认为水稻不同的品种在不同生育期对立枯丝核菌的反应有一些差异,—般而言,生育前期比生育后期较抗病。

以潮霉素B抗性基因为选择标记的水稻立枯丝核菌遗传转化体系的构建

使用含裂解酶(来自Trichoderma harzianum)10mg/ml的0.8MNaCl(Ph5.8),28℃下,处理水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝8小时,获得其原生质体。采用PEG介导的方法,将含有潮霉素B抗性标记的质粒pSM565转入水稻立枯丝核菌的原生质体,并在潮霉素B浓度为30μg/ml的选择性培养基上筛选转化子,获得了5-6个转化子/μgDNA的转化频率。随机挑选8个转化子,通过PCR方法检测到其中存在潮霉素抗性基因。

棉立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)中的一个dsDNA病毒

自从1962年Hollings在栽培蘑菇(Agaricus bisporus)中发现第一例真菌病毒以来,迄今已在100多种真菌中发现了病毒,多数含双链RNA基因组。1972年Bozarth报道在R.solani中发现病毒,但未报道该病毒的理化性质。1975年Finlker在R.solani的一个强致病力菌株中分离到双链RNA病毒,它含3个组分dsRNA。

立枯丝核菌毒素的产生及与致病力的关系

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)培养滤液经活性炭吸附、甲醇洗脱、旋转蒸发浓缩获得粗毒素。生物活性测定表明:该粗毒素能诱发水稻叶片产生似纹枯病的典型症状,明显抑制水稻胚根生长,致使水稻幼苗萎蔫;粗毒素浓度越高,作用越强,当稀释至200倍时仍具有一定生物活性;不同菌株产毒能力差异明显,且与致病力呈显著正相关。这些结果显示毒素在病菌致病过程中起重要作用。病菌最佳产毒条件为:菌丝在改良Richard培养液(pH 7)中,25～30℃下黑暗培养15～20 d,每隔6或12 h人工振荡1次。水稻不同抗(特青和J-85)、感(LMNT)品种的胚根和幼苗对粗毒素的敏感性有较大差异,预示毒素可用于水稻品种抗纹枯病的初步鉴定。