水稻矮缩病毒对黑尾叶蝉取食及产卵偏好性的影响

水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)是水稻普通矮缩病(Rice dwarf disease)的病原,主要依赖黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps经卵以持久增殖方式传播。本研究采用室内试验观测了带毒与无毒的黑尾叶蝉在健康及感病水稻间的取食、产卵选择趋性。取食偏好性试验发现,无毒叶蝉对感病水稻趋性更强,从观测的第8小时开始达显著差异水平;带毒叶蝉则对健康水稻趋性更强,在观测的第24小时开始达到显著差异水平,表明RDV侵染水稻会引起黑尾叶蝉取食偏好性的改变。产卵偏好性试验发现无毒及带毒黑尾叶蝉在健康及感病水稻间3个观测指标(每植株卵块数、每卵块的卵量及每植株上的总卵量)均无显著差异,表明RDV侵染水稻对黑尾叶蝉产卵选择偏好性无显著影响。本文初步明确RDV对黑尾叶蝉取食和产卵偏好性的影响,为揭示介体昆虫-病毒-寄主植物三者之间的互作机制提供佐证。

南方水稻黑条矮缩病毒在广西兴安的迁入与侵染动态

广西兴安地处白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)迁入廊道要冲,南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)依赖白背飞虱携传。本研究采用探照灯诱集高空白背飞虱,同时采集田间白背飞虱和稻叶,采用dot-ELISA法检测白背飞虱及水稻的带毒状况,以明确SRBSDV的迁入与侵染动态。综合来看,2021年-2022年间兴安的带毒白背飞虱迁入始期为5月下旬,迁入白背飞虱的带毒率高峰为6月中下旬;田间白背飞虱7月上旬-7月下旬带毒率较高(10%~15%);水稻7月中旬-8月上旬带毒率较高(10%~14%)。水稻带毒率与田间白背飞虱带毒率之间存在显著相关关系。本文结果有助于桂北和长江中下游地区开展白背飞虱携传SRBSDV的监测预警。

南方水稻黑条矮缩病毒P7-2基因的克隆与原核表达

【目的】为克隆获得南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的P7-2基因并实现其原核表达。【方法】利用RT-PCR技术从感染SRBSDV的水稻叶片中扩增出P7-2基因。利用Gateway重组技术将基因P7-2整合到原核表达载体pDEST17上,获得重组原核表达载体pDEST17-P7-2。随后将原核表达载体pDEST17-P7-2转化到原核表达菌株Rosetta中。利用IPTG诱导P7-2蛋白表达并优化其诱导条件。【结果】利用RT-PCR技术扩增得到基因P7-2,其大小为930 bp。测序结果表明获得原核表达载体pDEST17-P7-2。菌液PCR鉴定了原核表达阳性菌株。在温度为28℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导表达8 h,可获得大量大小约为42 kDa含HIS标签的融合蛋白。【结论】克隆获得了SRBSDVP7-2的基因序列,实现了该基因的原核表达并探索其最佳诱导条件,为南方水稻黑条矮缩病的田间诊断、预测预报及P7-2的功能研究奠定了基础。

南方水稻黑条矮缩病流行及防控

水稻黑条矮缩病由呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)引起,该病害2001年首次在中国广东阳西县发现,2009年在中国南部大部分地区大面积发生,波及中国南方9个省(自治区)。

水稻矮缩病毒云南、浙江分离株侵染水稻植株的细胞病理比较研究

应用超薄切片电镜技术比较观察RDV云南和浙江分离株侵染水稻植株的细胞病理。RDV云南分离株侵染的水稻叶片中,充满病毒粒体的细胞呈条带状分布,呈现出明显的侵染和增殖中心,在充满病毒粒体的细胞周围,相邻细胞有不同程度的病变,叶绿体膜系统消失,部分叶绿体中含有病毒颗粒,线粒体残体及细胞质中有分散或聚集的病毒粒体,细胞核中未见病毒粒体,离侵染中心较远的细胞中亚细胞结构较完整;RDV浙江分离株侵染的水稻叶片中,部分细胞充满病毒粒体,无明显的条带状分布,其他细胞病理特征与RDV云南分离株侵染的水稻叶片相似。RDV不同分离株侵染寄主植株的细胞病理特征无显著差异,对其致病性的差异需进一步研究。

一种快速同步检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法

水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒是近年来在水稻上危害日益严重的两种病毒,由于两者同属于呼肠孤病毒科斐济病毒属,在症状、粒体形状、传播介体及寄主等方面非常相似,由此也给诊断及鉴定造成了困难。针对这一问题,通过设计简并引物,并优化体系,建立了一种快速、简便、灵敏、特异的方法,为这两种病毒的检测及鉴别提供了方便。

西南稻区稻飞虱及引起水稻矮缩病病毒的分布研究

2010-2012年5-8月在西南稻区的四川、云南、广西、贵州和重庆等地对稻飞虱及其传播病毒病植株进行田间调查和室内鉴定.结果表明,白背飞虱在西南地区分布最广,且在各个调查均有发现;褐飞虱主要分布在西南稻区的东部和南部,四川盆地西部未见;而灰飞虱则主要分布在温度较低的滇西高原和四川盆地北部甚至更北的西南稻区,并在飞虱危害较轻的2011年成为田间优势种群;除滇西高原外,西南稻区各地水稻生长季节部分白背飞虱携带南方水稻黑条矮缩病毒,带毒率在2.5％～10.0％之间;南方水稻黑条矮缩病是西南稻区水稻当前最主要病毒病,历年在贵州东南部发生危害,部分田块矮化株带毒率达到100.0％,但在滇西高原和四川盆地未见其危害;在褐飞虱和白背飞虱混合发生地区,南方水稻黑条矮缩病毒和水稻锯齿矮缩病毒能复合侵染水稻;而在白背飞虱和灰飞虱混合发生地区的云南保山发现有水稻条纹叶枯病,在四川新都则发现了水稻黑条矮缩病.

湖北发生的水稻矮缩病是南方水稻黑条矮缩病毒引起的

近年来由水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒引起的水稻黑条矮缩病在华南、华东等地区暴发流行,给水稻生产带来严重损失,而湖北一直未有水稻黑条矮缩病流行的报道。然而,2009年和2010年在湖北省长江沿线的荆州、孝感、咸宁、黄石、鄂州、黄冈等水稻种植区普遍发生水稻矮缩减产的现象。经过症状观察、dsRNA电泳图谱分析、RT-PCR等方法,诊断该病是由南方水稻黑条矮缩病毒引起,说明该病毒已经随介体昆虫白背飞虱从我国南方传播至中部水稻种植区。

水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立一种快速、灵敏的逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)检测寄主植物和传毒介体体内的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)。【方法】合成4条针对RBSDV S10核苷酸序列6个位点的特异性引物。分别对引物浓度、MgSO4浓度、反应温度和时间进行优化。将感病水稻总RNA梯度稀释后进行灵敏性检验并与RT-PCR比较分析。选择RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)验证该方法的特异性。用本RT-LAMP方法检测田间病株。【结果】RT-LAMP检测方法可排除SRBSDV的干扰而特异地检测植物和飞虱体内的RBSDV,与RT-PCR灵敏性基本一致。检测结果易于判定。【结论】RT-LAMP检测方法适合寄主植物和介体体内RBSDV的快速检测。

水稻矮缩病毒第七号基因的序列分析及在大肠杆菌中的表达

应用反转录-PCR技术合成并扩增了水稻矮缩病毒(RDV)中国福建分离物基因组第七号片段(S7)cDNA,将PCR产物克隆在载体 pBluescript SK(+)上,进行了亚克隆和序列分析。结果表明克隆片段全长1578bp,含有一个1518bp长的开放阅读框架(ORF),编码一个由506个氨基酸组成的理论分子量为56000的蛋白。该片段与RDV日本分离物基因组的相应片段相比,在核苷酸及氨基酸水平上的同源率分别为93.2％和94.1％。该片段编码的56000蛋白与同属的伤瘤病毒(WTV)基因组第七号片段编码的57000蛋白相比,在靠近N端的区域(aa61～aa141)有较高的氨基酸序列同源性。将RDV S7 cDNA克隆到原核表达载体 pBV221上,通过温度诱导在大肠杆菌中得到表达。表达产物占菌体可溶性总蛋白的13.73％。对表达产物进行了 Western blotting分析。本工作为进一步纯化RDV S7编码蛋白、分析其功能和转化水稻打下了良好基础。

水稻矮缩病毒第十二号基因组份的cDNA合成与分子克隆及全序列分析

应用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ）扩增了水稻矮缩病毒（ＲＤＶ）中国福建分离物基因组第１２号片段（Ｓ１２）的全基因序列，并对该基因进行了亚克隆和序列分析。结果表明克隆片段全长为１０６６ｂｐ，含有４个开放阅读框架（ＯＲＦ），分别编码３４ｋＤ、８ｋＤ、７ｋＤ和４ｋＤ的多肽。与日本ＲＤＶＳ１２在核苷酸水平上的同源率为９４．５％，与相应ＯＲＦ（ＯＲＦ１－４）编码多肽的同源率分别为９１．３％、９７．８％、９７．６％和８４．４％。此外，将这几个ＯＲＦ编码的多肽与同组伤瘤病毒（ＷＴＶ）、水稻瘿矮病毒（ＲＧＤＶ）相应ＯＲＦ编码的多肽进行同源性比较发现，３４ｋＤ多肽与ＷＴＶ和ＲＧＤＶ相应多肽无显著的序列同源性，但ＯＲＦ２和ＯＲＦ３编码的多肽在同组中却有明显的保守性。由此说明这几种小的多肽在病毒侵染和复制中有着十分重要的作用。

2种水稻矮缩病毒一步检测方法的建立

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)是引起水稻矮缩病的2种主要病毒,这2种病毒病在田间危害症状较相似,难以准确鉴定。为建立这2种病毒的一步快速检测方法,从混合引物配比、退火温度2个方面优化了反应体系与反应程序,并用这2类病毒的总RNA进行了RT-PCR验证,最终建立了准确、灵敏、快速的一步检测方法。利用建立的方法对从江西省大余县和南昌县采集的水稻矮缩病毒叶片样品进行检测。结果表明:大余县10份样品均为南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV),检出率为100%;南昌县10份样品中有7份样品检出南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV),检出率为70%,另外3份样品检出水稻黑条矮缩病毒(RBSDV),检出率为30%。

水稻黑条矮缩病毒与南方水稻黑条矮缩病毒的检测及其在江西省的区域分布

为明确水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)这2种病毒在江西省的分布,首先从永修县、南昌县和大余县等8县市采集水稻疑似矮缩病株,用2种病毒一步检测法对这2种病毒进行RT-PCR检测。结果表明:永修县所有样品均检出RBSDV,检出率为100%;南昌县同时检出RBSDV和SRBSDV,检出率分别为90%和20%,其中南昌县的1个样品同时检出2种病毒,存在复合侵染;大余县、莲花县、崇义县、婺源县、万安县和井冈山市等6县的所有样品均检出SRBSDV,检出率100%。然后,对这2种病毒在江西省的分布特点进行分析。统计分析结果表明:江西省西南部和东北部只有SRBSDV分布,江西省北部只有RBSDV分布,而处于以上3个病毒重发区之间的南昌县同时有RBSDV和SRBSDV分布。同时基于S9序列和S10序列建立这2种病毒及其近缘种的系统发育树,分析其亲缘关系。

水稻矮缩病毒的检测和介体传毒能力初步分析

快速从水稻叶片和单头介体昆虫中检测水稻矮缩病毒的斑点分子杂交。与10%SDS-PAGE检测方法相比,不仅敏感、快速、简单,可以检测田间批量样品,用于病害流行研究和测报,而且可以用于介体叶蝉传毒能力的分析。研究表明:用本地黑尾叶蝉分别接种RDV本地分离物和云南分离物,斑点杂交显示介体带毒率相似,分别为84%、75%,但生物学接种结果差异相当大,分别为28.1%、3.8%,另外斑点杂交显示云南病区的黑尾叶蝉带毒率为88%,说明介体叶蝉的传毒能力具有地域性,介体叶蝉带毒率与传毒能力也存在一定差异。

16个水稻品种对水稻矮缩病毒抗性的鉴定

16个水稻品种对水稻矮缩病毒(Rice dwarfvirus,RDV)的抗性鉴定结果表明:不同水稻品种对RDV的抗性存在明显差异.根据各品种的发病率划分其抗性等级.免疫品种1个,占供试品种的6.25%;中抗品种6个,占37.50%;中感品种3个,占18.75%;高感品种6个,占37.50%.感病品种潜育期较短,为11-15 d左右;抗病品种潜育期较长,为15-20 d左右.水稻品种的发病率与叶蝉带毒率密切相关,相关系数为99.99%.协优46兼具抗虫性和抗病性;宜香2292仅具抗病性;冈优734为免疫品种,是水稻矮缩病抗性育种的良好材料.

灰飞虱从冷冻病叶获得水稻黑条矮缩病毒方法的研究初报

研究出一种利用灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒(riceblack-streaked dwarf virus,RBSDV)的方法。以-70℃条件下冷冻保存的RBSDV罹病植株叶片对灰飞虱饲毒,随后接种感病水稻品种,结果发现灰飞虱可从冷冻病叶上获得RBSDV,并传播RBSDV,且获毒能力和传毒能力与新鲜病叶没有差异。这表明从冷冻病叶上获得RBSDV的灰飞虱可以应用于品种抗性鉴定,此法可望加快RBSDV抗病品种的选育进程。

水稻矮缩病毒基因组第八号片段的cDNA克隆序列分析及在大肠杆菌中的表达

从水稻矮缩病毒（ＲＤＶ）中国福建分离物中分离出基因组第八号片段ｄｓＲＮＡ，经逆转录合成ｃＤＮＡ，应用聚合酶链式反应技术扩增了编码区ｃＤＮＡ，并克隆在ｐＧＥＭ３Ｚｆ（一）载体上。该片段编码病毒外层外壳蛋白。对重组子进行限制性内切酶分析，亚克隆及全序列测定，结果表明，克隆片段全长１３５ｂｐ含有一个１２６６ｂｐ的阅读框架，编码一个含有４２１个氨基酸的多肽。与日本流行株相应片段比较，核苷酸和氨基酸水平的同源率分别为９４．４％和９７．９％。另外，我们所克隆的片段在距起始密码子５３２一５３４处较日本株系多了３个核苷酸，导致ＲＤＶ中国福建分离物外层外壳蛋白比日本株多出一个氨基酸。将该编码区ｃＤＮＡ克隆到原核表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＡ上，经ＩＰＴＧ诱导，用ＲＤＶ抗体进行蛋白Ｗｅｓｔｅｍ印迹分析表明，该基因在大肠杆菌中得到高效表达。这项工作为以后进一步开展水稻抗矮缩病基因工程，研究ＲＤＶ与传毒介体昆虫之间的识别关系奠定了基础。

水稻矮缩病毒基因组第九号片段的cDNA克隆及序列分析

水稻矮缩病毒基因组第九号片段的ｃＤＮＡ克隆及序列分析曲林，辛毅，朱玉贤，陈章良（北京大学生命科学学院，蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室北京１ｌｌ８７１）关键词水稻矮缩病毒，第九号片段，序列分析水稻矮缩病毒（ＲｉｃｅＤｗａｒｆＶｉｒｕｓ，ＲＤＶ）...

水稻矮缩病毒基因组分析与部分基因片段的表达及功能研究

根据本实验室对水稻矮缩病毒（ＲｉｃｅＤｗａｒｆＶｉｒｕｓ，ＲＤＶ）中国福建分离株基因组全序列的测定，分析了其编码蛋白的功能，并将ＲＤＶＳ６，Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ１１编码区ｃＤＮＡ分别克隆到表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＡ，ｐＢＶ２２１，ｐＴｒｃＨｉｓＢ和ｐＢＶ２２１中，构建成表达质粒ｐＴＨ－Ｓ６，ｐＢＶＰ９，ｐＴＨ－Ｓ１０，ｐＢ－ＶＰ１１。分别用ＩＰＴＧ或温度诱导大肠杆菌ＤＨ５α，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及相应抗体的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测证明Ｓ６，Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ１１编码蛋白在大肠杆菌中获得成功表达。另外，还将ＲＤＶ外层外壳蛋白基因Ｓ８、微核心蛋白基因Ｓ７及编码非结构蛋白基因Ｓ９通过基因枪导入到水稻植株中，抗病性正在研究之中。

南方水稻黑条矮缩病毒S6编码一个沉默抑制子

【目的】分析南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)基因组S6编码的SP6蛋白的抑制子活性,明确SRBSDV是否编码RNA沉默抑制子来干扰植物的沉默。【方法】将分别含有SP6与GFP质粒的农杆菌共浸润转GFP基因的16c本氏烟纯合系,观察SP6对局部沉默和系统沉默的抑制作用;将含有SP6,GFP和dsGFP质粒的农杆菌三者共浸润,观察SP6对由dsRNA引起的沉默的抑制作用;在同一植株不同部位接种GFP和SP6,观察SP6对RNA沉默信号传导的影响;通过马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)在本氏烟上表达SP6,观察SP6是否能增强PVX的致病性。【结果】SP6能抑制由GFP正义RNA介导的沉默,但其抑制作用较弱,仅能延缓局部沉默和系统沉默的产生。SP6能灭活RNA沉默信号,阻止沉默信号的长距离传导,回复GFP的沉默,但不能抑制由dsRNA引起的沉默。利用PVX在本氏烟上表达SP6能增强PVX的致病性。【结论】SP6是病毒编码的RNA沉默抑制子,在RNA沉默的起始和信号传导阶段起作用。