H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

高温胁迫下水稻胚乳磷酸化与泛素化蛋白质组学联合分析

水稻胚乳的代谢依赖于多个翻译后修饰信号网络的精确调控,包括磷酸化和泛素化修饰。本研究通过磷酸化与泛素化蛋白质组学的联合分析,发现水稻胚乳中有143个蛋白质同时具有磷酸化和泛素化位点,这为研究磷酸化和泛素化修饰之间的串扰机制提供了组学基础。一方面,磷酸化修饰通过影响泛素-蛋白酶体系统中的关键蛋白来调控泛素化修饰;另一方面,泛素化修饰通过影响蛋白激酶和蛋白磷酸酶来间接调控植物体内的磷酸化信号网络。高温胁迫下,磷酸化和泛素化修饰协同调控酚类化合物的合成通路,并最终影响酚类化合物清除活性氧的能力以及植物在逆境中的抗性。多种淀粉代谢相关酶同时具有磷酸化和泛素化修饰,并且有18对具有不同修饰类型的位点出现在同一蛋白质的相邻位置,揭示了不同修饰之间的串扰机制以及高温胁迫中磷酸化与泛素化修饰对淀粉代谢的协同调节作用。

改良提取水稻胚乳和拟南芥花柱中DNA和RNA的SDS法

在冷酚法的基础上,经多次实践改进,得出一种简单、快速的SDS法,可以从富含多糖的水稻胚乳和富含多酚的拟南芥花柱中同时提取总DNA和总RNA,所得DNA和RNA样品经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分析证明具有较高的纯度和完整性,并可进一步满足PCR和RT-PCR的实验需要。

禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白在水稻胚乳中的稳定、高效表达及活性鉴定

为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白。首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植。利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T0阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T1叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T3植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性。结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-HA成功导入到根癌农杆菌EHA105中;PCR检测到有66株植株的HA基因成功整合到水稻基因组;Dot Blot和Western Blot检测结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达;利用荧光定量PCR方法,107株T1中筛选到31株纯合植株;Western Blot检测结果表明,杂交后的HA蛋白表达量大幅度提高;双抗夹心ELISA结果证实,水稻胚乳表达的HA蛋白的活性高于杆状病毒-昆虫细胞。

水稻胚乳细胞生物反应器研究进展

水稻胚乳细胞生物反应器是一种理想的生物活性物质生产工厂,本文综述了以水稻胚乳细胞为生物反应器生产药物蛋白、疫苗、功能肽及非蛋白类生物活性物质的研究进展。

水稻胚乳注射法

广东省新会县环城公社农科站,于1959年早造播种了用胚乳交换法杂交的一个组合,“矮仔占”+→“意粳4号”。“矮仔占”是广东一个矮型高产迟熟秈稻品种,“意粳4号”是一个外国大粒型早熟粳稻品种,粒大穗大,但不抗病。希望通过胚乳注射将“意粳4号”大粒、千粒重高、早熟等特性传递给“矮仔占”,育成穗大、粒大,早熟的新品种。

水稻胚乳表达药用重组蛋白研究进展

对于目前居高不下的药价及某些疑难杂症而言,采用植物表达体系生产药物是非常有效的解决途径。在植物表达系统中,水稻胚乳是公认的表达药用重组蛋白的理想工具之一。然而由于表达水平、蛋白活性及公众担忧等技术或非技术的因素,至今尚无转基因水稻胚乳表达体系进入商业化生产药用重组蛋白阶段。基于此,本文综述了在水稻胚乳中表达的各类药用蛋白的研究进展,从目标基因密码子偏好性、启动子选用、目标蛋白定位、人源化活性及蛋白储藏等方面介绍了水稻胚乳表达系统的改良研究,在此基础上分析影响转基因水稻商业化生产药用蛋白的具体限制因子,并展望该体系的发展及应用前景。

HPV45-L1和HPV58-L1蛋白植物表达载体的构建及水稻转基因植株的鉴定

利用水稻胚乳细胞生物反应器,构建含有HPV45-L1和HPV58-L1基因的重组植物表达载体,为HPV-45L1和HPV58-L1蛋白的表达提供一种新的高效、低廉的表达方式。利用PCR技术克隆人乳头瘤病毒HPV45-L1和HPV58-L1蛋白编码基因,将其重组于中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA-1300中,构建含HPV45-L1和HPV58-L1基因的植物表达载体pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1、pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1,随后采用根癌农杆菌侵染水稻愈伤组织介导的水稻遗传转化,获得HPV-L1转基因水稻植株。PCR检测结果表明,HPV45-L1和HPV58-L1基因已整合到水稻基因组中,说明已成功构建水稻胚乳特异性表达载体。

人乳头瘤病毒31和33亚型L1基因导入水稻及转基因植株的鉴定

目的:结合水稻胚乳生物反应器的优点,将人乳头瘤病毒(HPV)31、33亚型的L1蛋白编码基因导入水稻,构建HPV31 L1、HPV33 L1植物表达载体,最终实现其在水稻胚乳表达系统中的表达。方法:利用生物信息学方法分析并优化合成HPV31及HPV33 L1蛋白编码基因,将其重组于中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300中,分别构建植物双元表达载体pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1,采用遗传转化法经根癌农杆菌介导转化水稻TP309种子的愈伤组织,经共培养、潮霉素筛选和分化再生,获得潮霉素抗性植株。结果和结论:构建了HPV31 L1、HPV33 L1的植物表达载体,经根癌农杆菌介导转化水稻TP309种子的愈伤组织,获得转基因植株。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株,HZ96)VP2基因的质粒PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.5kb左右长的VP2基因产物;用Kpn 和Sal 酶切纯化的PCR产物;将纯化的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301水稻胚乳特异性启动子GT1下游,并经PCR、酶切和测序鉴定。植物重组表达载体经三亲交配已导入根癌农杆菌中。

华中农业大学揭示稻米中油脂合成的新途径

近日,华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室、生命科学技术学院水稻分子育种团队在Molecular Plant在线发表了题为“Genetic Architecture and Key Genes Controlling the Diversity of Oil Composition in Rice Grain”的研究论文,研究鉴定了水稻胚乳中11个油脂相关性状的99个QTL,克隆了4个对油脂组成自然变异有重要贡献的新基因,提出了水稻籽粒油脂生物合成的新途径,解析了稻米油脂合成遗传基础的最新研究成果。

中山大学生命科学学院陈月琴教授研究组在非编码RNA与作物性状研究取得重要进展

中山大学生命科学学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室陈月琴教授团队首次发现了调控水稻胚乳发育的长链非编码RNA。该工作以“The parent-of-origin lncRNA MISSEN regulates rice endosperm development”为题,于2021年11月11日在线发表在Nature Communications。胚乳是水稻种子的主要食用部分,胚乳的发育情况直接影响稻米的产量和品质。长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过200 nt的非编码RNA,其数量众多,但绝大部分的功能都还是未知的。lncRNA在胚乳发育中的功能还不清楚。

稀土元素对种子萌发中淀粉酶活性的影响

用稀土溶液浸种,可以促进种子萌发和幼苗的生长。稀土元素直接对水稻幼苗的生长效应、种子的呼吸强度、可溶性糖含量及根内过氧化物同工酶的活性的影响都已有报道,并且发现高浓度的稀土溶液能抑制水稻胚乳中淀粉酶的活性。

黄金大米或于2020年前大规模种植

据澎湃新闻8月14日报道,亚洲最大的国际农业科研机构——国际水稻研究所正在向美国、加拿大等地相关机构申请对一种转基因＂黄金大米＂的安全认证。相较于普通大米,这种黄金大米增加了β-胡萝卜素,从而可防治维生素A缺乏症。这种疾病困扰着全球上亿儿童的健康成长。国际水稻研究所预计,第一个转基因黄金大米性状的高产品种将于2020年前能大规模商业化种植。