H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

人乳头瘤病毒31和33亚型L1基因导入水稻及转基因植株的鉴定

目的:结合水稻胚乳生物反应器的优点,将人乳头瘤病毒(HPV)31、33亚型的L1蛋白编码基因导入水稻,构建HPV31 L1、HPV33 L1植物表达载体,最终实现其在水稻胚乳表达系统中的表达。方法:利用生物信息学方法分析并优化合成HPV31及HPV33 L1蛋白编码基因,将其重组于中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300中,分别构建植物双元表达载体pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1,采用遗传转化法经根癌农杆菌介导转化水稻TP309种子的愈伤组织,经共培养、潮霉素筛选和分化再生,获得潮霉素抗性植株。结果和结论:构建了HPV31 L1、HPV33 L1的植物表达载体,经根癌农杆菌介导转化水稻TP309种子的愈伤组织,获得转基因植株。