基于分子对接技术筛选水稻黄单胞菌CSE抑制剂

由水稻黄单胞菌(Xoo)引起的水稻白叶枯病通常会给水稻带来严重危害;由于抗生素类药物的广泛使用,Xoo出现了耐药性.细菌通过体内的胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)产生内源性硫化氢(H2S)是其增强耐药性的重要方式.为降低Xoo的耐药性,基于分子对接技术,以Xoo体内的CSE为靶标,从68个吲哚类生物碱中虚拟筛选CSE抑制剂.结果显示,化合物1-hydroxyrutaecarpine、indican和strictosamide对靶蛋白的亲和力分别为-36.40、-35.15和-34.30 kJ·mol^(-1),均低于参考化合物NL3(-33.89 kJ·mol^(-1)).上述化合物的部分结构均能嵌入蛋白活性空腔并与周围氨基酸产生较为稳定的相互作用.由此推测化合物1-hydroxyrutaecarpine、indican和strictosamide可能会对Xoo体内的CSE产生一定的抑制作用.

MutL调控水稻黄单胞菌的致病力

为了了解水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)中的MutL/MutS系统是否参与DNA修复以及是否调控病原菌的致病力,构建了mutL突变体,比较了野生型与mutL突变体的突变率差异,野生型、mutL突变体及其互补菌株侵染水稻的能力。结果显示,mutL突变导致Xoo在H_(2)O_(2)胁迫下的突变率显著升高,mutL突变导致Xoo致病力下降,表明DNA错配修复蛋白MutL参与Xoo的DNA修复并正调控Xoo致病力。

一株能通过接合导入外源质粒的水稻黄单胞菌水稻致病变种菌株的获得及鉴定

从2008年10月在广西防城港市不同稻区采集的表现水稻白叶枯病症状的叶片中分离、纯化,得到22株水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)疑似菌株。在水稻品种日本晴、9311和特优63上剪叶接种,22个菌株都可在这3个水稻品种上引起典型的水稻白叶枯病症状,证实他们是Xoo菌株。以2007年从该地区采集的患病水稻叶片中分离得到的11个Xoo菌株和该22个菌株作为出发菌株,分离、纯化得到每个菌株的链霉素抗性突变体。通过三亲本接合检测向该33个链霉素抗性突变体导入广谱克隆载体pLAFR6的效率,结果得到2株可导入pLAFR6的突变体K74和K31,K74和K31的导入pLAFR6效率分别为2.9×10-2、9.0×10-6。经16SrRNA基因序列测定证明K74属于Xoo,即菌株K74可作为研究Xoo与水稻相互作用机理的一个菌株。

水稻黄单胞菌hrp基因簇中致病相关基因hpaB的鉴定

由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。通过筛选18000个XooTn5转座子插入突变体,得到其中一个致病力缺失的突变体XOG11。TAIL-PCR方法分离该突变体中插入转座子的侧翼序列,发现转座子插入到位于hrp基因簇的hpaB基因中。对该基因进一步的分析表明该基因编码一个含有156个氨基酸,等电点为4.28,亮氨酸含量为14.4%的蛋白HpaB。Southern blot和PCR验证表明Tn5在该突变体中为单拷贝插入且未发生转座子携带侧翼序列的转移。将hpaB克隆到具有广泛寄主的质粒pHM1中,转化重组质粒进入突变体后,突变体恢复了在其寄主水稻IR24上的致病力,而转化空质粒pHM1后的突变体仍然表现为致病力缺失。证实了水稻黄单胞菌中hpaB基因与该细菌的致病力相关,在侵染水稻的过程中起着不可缺失的作用。

水稻黄单胞菌水稻致病变种的超氧化物歧化酶活性及诱导

以水稻黄单胞菌水稻致病变种 (Xanthomonasoryzaepv .oryzae)的毒性菌株PXO99A和无毒菌株PXO99A(pBUavrXa1 0 F1 ) ,检测液体培养中菌体超氧化物歧化酶 (SOD)活性变化 ,以说明SOD与菌株致病性的关系。结果表明 ,菌体SOD活性高峰出现于延迟期末 ,之后下降 ;毒性菌株SOD活性高于无毒菌株。两个菌株的SOD活性的胞内定位均以胞质为主 ,占总活性的 70 %以上 ;酶体周质中SOD活性占总活性的 2 0 %～ 30 %。以 50～ 80 0 μmol/L外源O-2 处理细菌培养物 1h ,可诱导菌体中SOD活性的增加。其中以 2 0 0 μmol/LO-2 处理SOD活性最高 ;1 2h菌龄培养物的诱导效果优于 2 4h培养物 ;对毒性菌株SOD的诱导作用更为明显。外源O-2 处理后细菌存活率明显降低 ,2 4h培养物的存活率下降大于 1 2h培养物 ;毒性菌株存活率下降大于无毒菌株。

水稻黄单胞菌生物抑制剂的发酵及条件优化

本研究通过分析不同的培养基条件下海绵放线菌对水稻黄单胞菌的抑菌效果,以获取最优的发酵培养基配方。研究发现7种培养基中,ISP2培养基是最优的海绵放线菌的发酵培养基,添加不同种类和浓度的附加碳源和氯化钠对发酵液的抑菌效果没有明显的改善。由实验结果可知,添加15 g/L硫酸铵的ISP2培养基是用于产活性物质抑水稻黄单胞菌生长的海绵放线菌发酵培养的最佳配方。

水稻黄单胞菌三型分泌系统效应物的研究进展

水稻黄单胞菌(X.oryzae)三型分泌系统(TypeⅢsecretion system,T3SS)效应物(Effector)一直被认为是水稻黄单胞菌最重要的致病因子之一。水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和水稻黄单胞菌栖稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)分别引起水稻两大细菌病害水稻白叶枯病(Bacterial leaf blight)和水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak)。基因组分析揭示,水稻黄单胞菌中至少存在28个类型的T3SS效应物,分为TAL(Transcription activator-like effectors)效应物和non-TAL效应物(Non transcription activator-like effectors)两大类。通过对水稻黄单胞菌中T3SS效应物的数量、种类、结构、宿主靶标等方面进行综述,为全面了解水稻-水稻黄单胞菌互作的分子机理,调控网络以及水稻分子育种提供一种新洞察力。

水稻黄单胞菌致病相关基因插入突变体系的建立

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)是水稻上的模式病原菌,分别引起水稻白叶枯病(bacterial blight,BB)和细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)。为了精确和高效地实现目的基因的突变,本研究利用pK18mobGⅡ载体,建立了一套适于Xoo和Xoc目的基因定点插入的突变体系。通过同源片段与目的基因间的同源重组,成功获得了Xoo和Xoc的hrcV和hrpF突变体。PCR和Southern杂交证实:pK18mobGⅡ携带不同大小的同源片段,能够整合于hrcV和hrpF的特定位点;200～400 bp的同源片段能够获得最佳的突变效率;两亲接合的转化效率是电转化的5～100倍。毒性测定结果显示,hrcV基因决定着Xoo在水稻上的致病性。致病相关基因插入突变体系的建立为研究水稻黄单胞菌与水稻互作中致病相关基因的功能奠定了遗传学研究基础。

植物水通道蛋白结构与功能及其识别与转导水稻黄单胞菌Hpa1信号的机制

植物水通道蛋白PIP不仅担负细胞间或细胞内外水分子输导的基本功能,还参与植物-微生物互作与植物防卫反应,这种双重功能的调控机制目前还不清楚。水稻OsPIP1;2和拟南芥AtPIP1;4可以与水稻黄单胞III型泌出蛋白Hpa1互作,Hpa1定位于植物细胞的质外体,诱导过氧化氢在质外体产生及向原生质转运,进而影响植物防卫反应与对病原细菌的抗性。根据植物水通道蛋白拓扑结构与病原细菌Ⅲ型分泌系统工作模型,水稻OsPIP1;2与Hpa1互作的功能域是互作发生的分子基础。互作引发信号转导,调控过氧化氢信号从植物细胞的质外体向原生质转运与植物防卫反应。由于Hpa1对Ⅲ效应蛋白来说具有转位子的功能特征,OsPIP1;2-Hpa1还可能对水稻黄单胞菌Ⅲ型效应蛋白从细菌细胞向植物细胞转运发生调控作用。围绕这些设想进行研究,可以深入阐释水稻-黄单胞菌互作机制,同时为植物水通道蛋白功能调控提供新的见解。

抗水稻黄单胞菌的苏云金芽胞杆菌菌株筛选及其活性物质

【目的】从400株苏云金芽胞杆菌菌株中筛选出拮抗水稻黄单胞菌活性最好的菌株YBT-2532,并对其抑菌活性物质进行分离。【方法】对苏云金芽胞杆菌YBT-2532产生的活性物质理化特性进行测定。【结果】该活性物质对温度、蛋白酶、p H均不敏感,70°C处理1 h仍保留有75%的活性;活性物质在p H 2.0-12.0较稳定;该活性物质溶于甲醇、微溶于乙醇、不溶于丙酮、二氯甲烷和氯仿。利用凝胶过滤、离子交换层析、固相萃取、高效液相色谱技术,对抑菌组分进行分离,并通过HPLC-IT-MS方法确定其分子量。纯化的活性组分是一种分子量为797.8 Da的强极性水溶性小分子。【结论】该活性物质性质与已知的来源于苏云金芽胞杆菌的抗菌活性物质不同,可能为新型抗菌物质。

新型水稻黄单胞菌噬菌体资源的发掘与功能鉴定

由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo）引起的白叶枯病是水稻种植过程中毁灭性的细菌病害,对我国经济和食品安全造成巨大威胁。施用抗生素和化学生物防治手段的防控效果并不稳定,且易污染环境,还存在食品安全问题。为了应对该病害不可预知的爆发,利用噬菌体防控水稻白叶枯病可以作为一种备选方案,以减少化学杀菌剂和抗生素的使用。本研究利用中国不同水稻产区的9株水稻黄单胞菌和模式菌株PXO99A为靶标,从32份土壤样品中分离到了15个高效的Xoo噬菌体单株,说明黄单胞菌噬菌体广泛存在于中国各地的土壤中。选取其中Xoo_sp8和Xoo_sp9,电镜观察确定其具有二十面体的头部和细长的尾部,为典型的有尾噬菌体。宿主谱检测分析发现Xoo_sp8和Xoo_sp9都可以感染除PXO99A以外的9株不同生理小种的水稻黄单胞菌,且在培养基条件下能有效抑制其生长。测定其基因组序列后,根据末端酶大亚基（large terminase subunit,terL）相似性建立其与已报道的不同细菌噬菌体间的系统发育树,发现这两株噬菌体都与已报道的Xoo噬菌体亲缘关系很远,为新型的Xoo噬菌体。本研究分离发掘了15个对Xoo高效感染的噬菌体,为利用噬菌体防控水稻白叶枯病相关杀菌剂产品开发提供了宝贵的种质资源,同时也提出了土壤环境是分离Xoo噬菌体的重要来源的观点。

水稻白叶枯病的发生及防治

水稻白叶枯病是我国水稻三大病害之一,在世界各地的水稻种植中普遍发生,病原菌为水稻黄单胞菌。水稻染病后,叶片枯萎,影响光合作用,水稻产量降低。1发病条件和传播途径病菌可在种子和病残体中越冬,携带病菌的种子和病残体是水稻白叶枯病发生的初侵染源,病菌可经风雨、灌溉和人为活动传播。

利用实时荧光定量PCR和数字PCR检测鉴定水稻细菌性条斑病菌

白叶枯病和条斑病是水稻重要的细菌性病害。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)属于同种下的2个致病变种。鉴别Xoo和Xoc对检疫和防控这2种病害至关重要。Xoo和Xoc中的铁-红酵母酸/铁-粪生素受体基因fhuE在进化过程中因不同程度地缺失而成为假基因。针对Xoc中有而Xoo中缺失的fhuE部分序列设计引物,筛选出Xoc特异引物XocFhuE-F(5’-ATCGAACGATGTCACCAGGG-3’)和XocFhuE-R(5’-AGAAACGTGCGGCCAGATAA-3’)。用XocFhuE-F/XocFhuE-R能只从Xoc菌株中仅扩增出159 bp片段,并结合荧光染料建立了SYBR Green实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和EvaGreen微滴数字PCR(digital PCR,dPCR)方法来检测鉴定Xoc。在20μL反应体系中加1μL模板,qPCR检测菌悬液中Xoc的下限是1.6×10^(4)CFU/mL,检测带菌种子中Xoc的下限是1.2×10^(3)CFU/粒;d PCR检测菌悬液中Xoc的下限是1.6×10^(3)CFU/mL,检测带菌种子中Xoc的下限是1.2×10^(2)CFU/粒。综上所述,基于Xoc特异引物XocFhuE-F/XocFhuE-R建立的SYBR Green qPCR和EvaGreen dPCR为检疫Xoc和监测预警水稻条斑病提供了高效的检测方法。

含肟酯/醚结构的枯茗醛衍生物合成及抑菌活性

以孜然精油的主要成分枯茗醛为原料,设计合成了系列含肟酯/醚结构的枯茗醛衍生物18个,并通过^(1)H NMR、^(13)C NMR和HRMS进行了结构表征;以地毯草黄单胞柑橘致病变种和水稻黄单胞菌为对象,采用浑浊度法对目标化合物的抑菌活性进行了评估。抑菌活性测试结果表明:化合物(Z)-4-异丙基苯甲醛-O-(3-甲氧基苯甲酰基)肟(4i)在质量浓度50μg·mL^(-1)下对地毯草黄单胞柑橘致病变种的抑制率为3280%,优于对照药剂叶枯唑(1688%);目标化合物(Z)-4-异丙基苯甲醛-O-(苯甲酰基)肟(4d)、(Z)-4-异丙基苯甲醛-O-(4-三氟甲基苯甲酰基)肟(4h)和(Z)-4-异丙基苯甲醛-O-(3-甲氧基苯甲酰基)肟(4i)在质量浓度100μg·mL-1下对地毯草黄单胞柑橘致病变种的抑制率分别为60.3%、31.37%和33.30%,优于对照药剂叶枯唑的抑制率(45.82%)。

水稻白叶枯病菌FabG同源蛋白生物信息学分析

【目的】拟运用生物信息学的方法对目标基因进行预测分析,为后续展开水稻白叶枯病菌FabG及脂肪酸代谢途径的实验室研究提供参考。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)FabG(EcFabG)序列,在Xoo PXO99^(A)菌株基因组中经同源性比对发现,PXO_03085、PXO_00989、PXO_03629、PXO_02411、PXO_02878、PXO_02709所编码蛋白与大肠杆菌FabG具有同源性,将该6个基因分别命名为XoofabG1~XoofabG6,并将其编码蛋白命名为XooFabG1~XooFabG6。进一步运用生物信息学在线分析软件对这6个蛋白与EcFabG进行了理化性质、蛋白结构、亲水性、跨膜结构、信号肽、磷酸化位点及蛋白相互作用网络方面进行预测分析。【结果】6个蛋白(XooFabG1~XooFabG6)在理化性质、亲水性和信号肽方面区别较大,其中XooFabG1是一个不稳定蛋白,属于短链脱氢酶家族,具有酮脂酰ACP还原酶活性,但蛋白稳定性差,很可能与细菌应激状态下的反应有关。XooFabG3被标注为3-酮脂酰ACP还原酶,与EcFabG相比,功能相差较大,推测与辅因子和维生素的代谢相关。XooFabG5具有酮脂酰ACP还原酶结构域(KR domain),但该结构域在蛋白质序列中所处位置与EcFabG相比差异较大,推测其催化底物可能与EcFabG不同。XooFabG6在各方面的性质与EcFabG最接近,推测XooFabG6为3-酮脂酰ACP还原酶并参与脂肪酸合成代谢。但XooFabG2和XooFabG4的功能还不明确。【结论】本文通过预测分析黄单胞菌水稻致病变种中6个同源蛋白的特性,推测了其中4个蛋白可能具有的功能,对研究Xoo的脂肪酸合成途径具有一定意义。

水稻白叶枯病致病性基因研究进展

稻黄单胞菌水稻致病变种[Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)]可引起水稻白叶枯病,是水稻病害中最严重的病害之一,其与水稻互作是基因对基因的关系。Xoo基因组测序的完成极大推动了对Xoo基因功能的研究。为此,该文对近几年来Xoo致病性基因的鉴定情况进行统计,并就致病性基因的突变菌株对水稻接种情况和菌株自身变化进行了归纳,较为详细阐述了当前对Xoo无毒基因的鉴定研究状况,为水稻抗白叶枯病育种以及研究致病基因和致病机制提供理论基础。

水稻白叶枯病生理生化机制的研究进展

以水稻 病原菌之间相互作用的两大方面 :寄主的侵染和宿主的防御作为文章线索 。

抗病重组水稻

美国Univ. of California at Davis(Davis,CA)和Scripps Research Inst. (La Jolla, CA)的科研人员在水稻中表达了能使之抗主要的水稻细菌性病害叶疫病的基因。他们的研究表明,细胞内的信号在调控植物抗病性中具有重要作用。

科学家编辑水稻DNA防御病原体

外媒称,细菌性枯萎病袭击着东南亚和西非的稻田。这是一种被研究得非常透彻的作物疾病,它常常被用作研究微生物与其寄主植物间相互作用的一个模型系统。这种病原体被称为水稻黄单胞菌水稻致病变种,简称Xoo,它通过劫持一些外排糖的水稻基因来维持生存。研究人员已研究出如何编辑水稻的基因组以阻止这种劫持行为。

水稻白叶枯病菌毒力基因tal17.5病理学功能的研究

[目的]类转录激活蛋白(transcription activator-like effectors,TALE)是稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)中的一类重要致病因子。挖掘新的毒力tal基因,对揭示水稻白叶枯病菌与寄主植物的互作关系具有重要意义。[方法]从水稻白叶枯病菌JXOV菌株中克隆了1个中间串联重复区含17.5个重复单元的tal基因,命名为tal17.5。将tal17.5转入Xoo菌株PXO99A中,在寄主水稻上研究了其致病力作用,将tal17.5转入ME2中研究了其诱导相关Os SWEET基因的表达情况;在非寄主烟草上研究了其对烟草防卫反应功能的影响。[结果]tal17.5导入PXO99A之后增强了PXO99A在所测试的22个水稻品种中的11个品种上的致病力,并减弱了PXO99A在烟草上的防卫反应,能够一定程度地诱导Os SWEET11和其他5个Os SWEET基因的表达。[结论]TAL17.5通过抑制植物的防卫反应发挥一定的毒力作用。