水稻矮缩病毒对黑尾叶蝉取食及产卵偏好性的影响

水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)是水稻普通矮缩病(Rice dwarf disease)的病原,主要依赖黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps经卵以持久增殖方式传播。本研究采用室内试验观测了带毒与无毒的黑尾叶蝉在健康及感病水稻间的取食、产卵选择趋性。取食偏好性试验发现,无毒叶蝉对感病水稻趋性更强,从观测的第8小时开始达显著差异水平;带毒叶蝉则对健康水稻趋性更强,在观测的第24小时开始达到显著差异水平,表明RDV侵染水稻会引起黑尾叶蝉取食偏好性的改变。产卵偏好性试验发现无毒及带毒黑尾叶蝉在健康及感病水稻间3个观测指标(每植株卵块数、每卵块的卵量及每植株上的总卵量)均无显著差异,表明RDV侵染水稻对黑尾叶蝉产卵选择偏好性无显著影响。本文初步明确RDV对黑尾叶蝉取食和产卵偏好性的影响,为揭示介体昆虫-病毒-寄主植物三者之间的互作机制提供佐证。

转基因水稻对水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)抗性评价

采用人工繁殖带毒褐飞虱（ Ｎｅｌａｐａｒｖａｔａ Ｌｕｇｅｎｓ） 攻毒接种，结合症状观察和ＲＴＰＣＲ 检测方法，对５７ 个含有水稻齿叶矮缩病毒（ＲＲＳＶ） Ｓ７ ，Ｓ９ 和Ｓ１０ 基因片段的转基因水稻对水稻齿叶矮缩病毒的抗性进行了评价。总体而言，大多数转基因稻发病率比受体品种的发病率要低。从中初步得到对ＲＲＳＶ 具有较强抗性的水稻转基因系３１５ 和３１６ ，其发病率分别为１５ ．８ ％ 和１３ ．３ ％ ；具有中等抗性的水稻转基因系１８４ 和３２８ ，发病率分别为２６ ．９ ％ 和２８ ．０ ％ ；而对照受体品种和当地感病品种的发病率则分别为１００ ％ 和８４ ．２ ％ 。将ＲＴＰＣＲ 的方法用于转基因稻抗性的检测，可提高检测的灵敏度。

应用RT-PCR方法检测水稻植株和介体昆虫体内的水稻齿叶矮缩病毒

将生物学接种和 RT- PCR检测水稻植株体内的水稻齿叶矮缩病毒的方法进行了比较 ,发现结果基本趋于一致 ,但总体上 RT- PCR检测阳性率稍高于生物学接种的发病率。将生物学接种检测褐飞虱介体内水稻齿叶矮缩病毒方法与 RT- PCR检测方法进行比较分析 ,发现 RT- PCR方法可以检测单头褐飞虱体内的水稻齿叶矮缩病毒 ,具有很高的准确性和灵敏度。

水稻齿叶矮缩病毒的研究进展

水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus,RRSV)属呼肠孤病毒科水稻病毒属,其所致的水稻齿叶矮缩病是东南亚、东亚和南亚一些国家的重要病害,病害的发生对当地的水稻生产造成严重影响。综述了国内外有关RRSV的生物学、分子生物学方面的研究进展及其所致病害的控制策略。

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的表达

通过有机试剂抽提，ＣＦ－１１纤维素柱层析，从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲｉｃｅＲａｇｇｅｄＳｔｕｎｔＶｉｒｕｓ，Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｉｓｏｌａｔｅ，简称ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组，即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ１到Ｓｅｇｍｅｎｔ１０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），然后设计合适的引物，用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增，以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ上，在大肠杆菌菌株ＤＥ３中用ＩＰＴＧ诱导表达，经超声波破菌、离心、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，得到纯化的分子量为６４ｋＤ的融合蛋白。

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白的原核表达、抗血清制备及初步应用

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白由基因组片段S10编码。从RRSV福建沙县分离物(RRSV-F)中获取该病毒的全基因组,根据RRSV泰国分离物核苷酸序列设计特异性引物获得S10编码区,利用Directional TOPO克隆技术,将S10连接至克隆表达载体pET100/D-TOPO构建重组质粒,并进行了序列测定和分析。重组质粒经IPTG诱导在BL21star(DE3)E.coli中高效表达约35 kD Pns10蛋白。将Pns10蛋白免疫新西兰大白兔制备了特异性的抗血清,间接ELISA法测定抗血清效价为1∶7 680,Western blot分析表明抗血清特异性强。表达产物及抗血清在Pns10蛋白的结构和功能研究中具有重要的应用价值,制备的抗血清可用于水稻病株和传播介体的检测以及病毒病的诊断。

水稻齿叶矮缩病毒在水稻病叶及传毒媒介昆虫组织内的形态

用饲毒后的褐稻虱进行单虫单苗接种,稻苗发病率达60％以上。对病株的叶脉脉肿部位及相应编号的褐稻虱唾液腺进行超薄切片后,在电子显微镜下观察,病株的筛管细胞和传毒昆虫的唾液腺细胞内可见到大量病毒颗粒,并以晶状排列或者包裹于管状组织中。病毒颗粒大小约为70nm,具有45nm致密核心为双链RNA的组成部分,在核酸和核衣壳之间尚有空隙。本文对病毒的细微结构进行了讨论,并提供进一步证据,说明我国发现的RRSV和国外报道起源于东南亚的RRSV是同一种病毒。

水稻齿叶矮缩病毒P8蛋白的抗体制备及其在水稻原生质体内的表达动态

水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus,RRSV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)成员。该病毒引起的水稻齿叶矮缩病在我国南方发病严重,成为我国水稻生产上的重要病害。通过建立水稻原生质体培养体系,对RRSV主要外壳蛋白P8在水稻原生质体内的复制与表达情况进行研究。通过原核表达对P8蛋白进行抗体制备,抗血清经Western印迹检测具有特异性,间接ELISA测得其效价为2 500倍左右。以制备的抗血清为探针,通过Western印迹检测到P8蛋白在病毒侵染原生质体后24h开始表达,48h左右达到最大值,60h后开始下降,但仍保持在较高水平;同时,利用荧光定量PCR技术,对病毒侵染水稻原生质体后的P8RNA含量进行检测,结果表明,P8RNA在8h时开始积累,32h左右达到最大值,48h后表达量开始下降到一个平台期。

水稻锯齿叶矮缩病毒的检测及介体传毒特性

分别建立了水稻锯齿叶矮缩病毒(RRSV)病株的dsRNA基因组检测法和单头介体褐飞虱带毒的RT-PCR法,并结合生物学接种试验,对介体传毒特性进行了初步分析.结果显示:dsRNA基因组鉴定法可以从0.5 g病株样品中快速检测到RRSV,RT-PCR法可以灵敏地应用于褐飞虱带毒、传毒情况的检测;饲毒后褐飞虱成虫、若虫的带毒率分别为75.0%、68.2%,传毒率分别为50.0%、32.5%,说明褐飞虱种群传播RRSV的能力很强,是高度亲和的群体.

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白在水稻原生质体内的表达

【目的】水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介体昆虫细胞内可形成类似病毒原质(viroplasm)的内含体,是RRSV侵染介体所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有类似功能及其表达情况如何未见报道。【方法】利用大肠杆菌系统表达Pns10蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体;通过水稻原生质体病毒侵染体系,利用免疫荧光技术分析Pns10蛋白在水稻原生质体内的分布情况,利用实时定量PCR技术和Western blot技术分别检测Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生质体内的积累情况。【结果】将Pns10基因克隆到Gateway系统原核表达载体p DEST17中,IPTG诱导表达成功后,制备融合蛋白抗血清。Western blot检测显示,该抗血清可检测感病水稻叶片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生质体后,Pns10蛋白可形成类似病毒原质的内含体;Pns10 RNA在病毒接种8 h后开始积累,24 h后达到最大值,随后开始下降;Pns10蛋白在24 h后开始表达,之后维持较高水平,60 h后略有下降。【结论】成功获得了Pns10抗血清;Pns10在水稻原生质体内成功表达,可形成类似病毒原质的内含体,并且Pns10 RNA的表达先于其蛋白的表达。

广西南方水稻黑条矮缩病毒及水稻齿叶矮缩病毒的分子检测

【目的】探索南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)和水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)的分子检测技术,了解两种病毒在广西的分布,为生产上开展两种病害的防治奠定基础。【方法】用RT-PCR技术检测采自广西各地的水稻、杂草及稻飞虱样品;用CF-11纤维素粉提取水稻茎叶组织中的dsRNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳观察dsRNA图谱。【结果】从水稻、稗草、五节芒、李氏禾和白背飞虱样品中获得850bp左右的SRBSDV序列,从水稻和褐飞虱样品中获得700bp左右的RRSV序列;首次从五节芒和李氏禾中检测到SRBSDV。SRBSDV单独侵染、SRBSDV和RRSV复合侵染可见8条dsRNA条带,但带谱不一致;RRSV单独侵染可见5条dsRNA带。在供检测的181株水稻样品中,除了来自北海、贵港和梧州市的水稻样品外,其余样品均检测到SRBSDV;除了来自梧州、贺州、玉林、贵港和来宾的水稻样品外,其余样品均检测出RRSV;其中带SRBSDV的样品数占44.8%,带RRSV的样品占21.5%,两种病毒复合感染占11.0%。【结论】研究设计的特异性引物能用于RT-PCR检测SRBSDV和RRSV、水稻样品提取dsRNA能快速直观地鉴定SRBSDV、RRSV单独感染及混合感染水稻。用设计的引物首次检测出SRBSDV的两种新寄主五节芒和李氏禾。

褐飞虱呼肠孤病毒干扰水稻锯齿叶矮缩病毒的初步研究

褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)可携带多种病毒,其中褐飞虱呼肠孤病毒(Nilaparvata lugens reovirus,NLRV)和水稻锯齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)均为ds RNA基因组的呼肠孤病毒。通过接种、ds RNA小量提取及RT-PCR等方法分析NLRV对RRSV传播和增殖的影响,初步探讨这两种呼肠孤病毒之间的关系。结果表明,褐飞虱携带NLRV比率高低影响褐飞虱接种RRSV效率;携带NLRV的褐飞虱种群接种RRSV后两种病毒的含量差异较大,NLRV的含量远远大于RRSV的含量,推测褐飞虱体内的NLRV某种程度上干扰了RRSV的传播和增殖。

水稻草状矮化病毒和水稻锯齿叶矮缩病毒的分子检测

【目的】明确采自福州水稻基地中水稻的病毒种类,为生产上有效防控水稻病毒病提供科学依据。【方法】从福建省福州市仓山区水稻基地采集有矮缩、黄化、分蘖增多等症状的水稻样品共9株,采用RT-PCR方法对其病原进行鉴定。根据水稻草状矮化病RGSV P6和水稻锯齿叶矮缩病RRSV P10的基因序列分别设计一对特异性引物,提取感病水稻样品和健康水稻叶片的总RNA,并进行RT-PCR扩增和测序。【结果】在9株水稻样品中,均扩增到500 bp左右的片段,与RGSV预期片段大小一致;有1株同时扩增到750 bp左右的片段,与RRSV预期片段大小一致,而健康水稻中均未扩增到相关条带。【结论】水稻病毒田间的毒源种类比较多,也常常出现复合侵染和隐症现象,因此仅通过病害症状表现很难诊断病毒病,需借助分子生物学手段才能作出正确的诊断。RT-PCR鉴定结果表明采集的9株矮缩水稻样品均感染RGSV,有一株复合感染RRSV。水稻病毒病病原的鉴定将为水稻病害的防治提供参考依据。

灰飞虱从冷冻病叶获得水稻黑条矮缩病毒方法的研究初报

研究出一种利用灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒(riceblack-streaked dwarf virus,RBSDV)的方法。以-70℃条件下冷冻保存的RBSDV罹病植株叶片对灰飞虱饲毒,随后接种感病水稻品种,结果发现灰飞虱可从冷冻病叶上获得RBSDV,并传播RBSDV,且获毒能力和传毒能力与新鲜病叶没有差异。这表明从冷冻病叶上获得RBSDV的灰飞虱可以应用于品种抗性鉴定,此法可望加快RBSDV抗病品种的选育进程。

广西主栽水稻品种抗水稻齿叶矮缩病鉴定

【目的】了解广西主栽水稻品种对水稻齿叶矮缩病的抗性水平,为病害的综合防控及抗病育种研究提供理论依据。【方法】采用苗期人工接种鉴定方法,结合发病症状和RT-PCR检测结果,明确45份广西主栽水稻品种对水稻齿叶矮缩病的抗性水平。【结果】测试的45个主栽水稻品种中未发现对水稻齿叶矮缩病抗病的品种,其中表现高感的有41个,占测试品种的91.11%,表现中感的有4个,占测试品种的8.89%。【结论】目前的广西主栽水稻品种对水稻齿叶矮缩病缺乏抗病性。

水稻矮缩病毒对介体昆虫黑尾叶蝉生物学参数及种群增长的影响

【目的】水稻矮缩病毒(RDV)是水稻普通矮缩病的病原。该病害主要依赖于黑尾叶蝉经卵以持久增殖方式传播,危害水稻。本研究旨在明确RDV对黑尾叶蝉存活、发育、繁殖和种群增长的影响,分析病毒对介体昆虫的间接影响。【方法】采用室内实验比较了黑尾叶蝉在健康水稻及感病水稻上的发育繁殖情况,组建了实验种群生命表,并调查了RDV对种群增长的影响。【结果】与健康水稻相比,感病水稻上叶蝉若虫期存活率更高,雌若虫发育历期显著缩短,雄成虫寿命显著延长,产卵量显著增加,其他生物学参数无显著差异。五个生命表参数仅净生殖率(R_0)存在显著差异,感病水稻上叶蝉R_0显著高于健康水稻。饲喂感病水稻的养虫笼内叶蝉种群增长更快,总成虫数量更多,在接虫后的第4、5和6月显著高于健康水稻上的数量。【结论】水稻矮缩病毒可以提高黑尾叶蝉的存活率和产卵量,并促进种群的增长。

水稻矮缩病毒对黑尾叶蝉生长发育和繁殖的影响

【目的】水稻普通矮缩病是一种常见的病毒性病害,对水稻生产造成了严重的威胁。水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)是该病害的病原物,主要依赖黑尾叶蝉经卵以持久增殖方式传播。探明水稻矮缩病毒对介体昆虫黑尾叶蝉的影响,可为黑尾叶蝉的种群治理和水稻普通矮缩病的可持续控制提供依据。【方法】设置健康与感病2个水稻处理,在室内27℃条件下,观测黑尾叶蝉的生长发育、种群增长情况,组建实验种群生命表。【结果】介体昆虫黑尾叶蝉在感染水稻矮缩病毒的水稻上取食后,若虫期存活率、成虫鲜重无显著差异,雌成虫寿命和产卵量略有延长/增加,但雌雄虫若虫发育历期和雄成虫寿命显著缩短,种群数量显著增多,5个生命表参数中净生殖率显著提高。【结论】感染水稻矮缩病毒的水稻对介体黑尾叶蝉存在有利的间接影响,水稻矮缩病毒有利于黑尾叶蝉种群的增长。

西南稻区稻飞虱及引起水稻矮缩病病毒的分布研究

2010-2012年5-8月在西南稻区的四川、云南、广西、贵州和重庆等地对稻飞虱及其传播病毒病植株进行田间调查和室内鉴定.结果表明,白背飞虱在西南地区分布最广,且在各个调查均有发现;褐飞虱主要分布在西南稻区的东部和南部,四川盆地西部未见;而灰飞虱则主要分布在温度较低的滇西高原和四川盆地北部甚至更北的西南稻区,并在飞虱危害较轻的2011年成为田间优势种群;除滇西高原外,西南稻区各地水稻生长季节部分白背飞虱携带南方水稻黑条矮缩病毒,带毒率在2.5％～10.0％之间;南方水稻黑条矮缩病是西南稻区水稻当前最主要病毒病,历年在贵州东南部发生危害,部分田块矮化株带毒率达到100.0％,但在滇西高原和四川盆地未见其危害;在褐飞虱和白背飞虱混合发生地区,南方水稻黑条矮缩病毒和水稻锯齿矮缩病毒能复合侵染水稻;而在白背飞虱和灰飞虱混合发生地区的云南保山发现有水稻条纹叶枯病,在四川新都则发现了水稻黑条矮缩病.

水稻矮缩病毒的检测和介体传毒能力初步分析

快速从水稻叶片和单头介体昆虫中检测水稻矮缩病毒的斑点分子杂交。与10%SDS-PAGE检测方法相比,不仅敏感、快速、简单,可以检测田间批量样品,用于病害流行研究和测报,而且可以用于介体叶蝉传毒能力的分析。研究表明:用本地黑尾叶蝉分别接种RDV本地分离物和云南分离物,斑点杂交显示介体带毒率相似,分别为84%、75%,但生物学接种结果差异相当大,分别为28.1%、3.8%,另外斑点杂交显示云南病区的黑尾叶蝉带毒率为88%,说明介体叶蝉的传毒能力具有地域性,介体叶蝉带毒率与传毒能力也存在一定差异。