水稻T-DNA插入突变体库筛选及其突变特征研究

采用水培方法大规模苗期筛选水稻T-DNA插入突变体库,以苗期表观症状为参考指标,从2 173个T1代家系中共筛选分离出表型突变家系145个。突变体类型分为4类,即氮营养缺陷型突变型、白化苗型、黄化苗型、植株矮小型。

T-DNA插入水稻群体中卷叶突变体R1-A2的遗传分析

在根癌农杆菌介导的T-DNA(携带有除草剂Basta抗性基因bar和Ds因子)转化中花11水稻群体中,获得了一个叶片发生明显内卷的突变体R1-A。经过连续三代的分离鉴定,获得突变体的纯合株(R1-A2),并与中花11号进行杂交,在调查的36个F_1植株中,全部表现为卷叶,并对Basta除草剂都表现为抗性。在852个F_2单株中,卷叶为645株,正常叶207株,卷叶和正常叶的比例为3:1,其中,卷叶株均对Basta表现抗性,正常叶株均对Basta表现敏感,表明卷叶性状和Basta抗性存在着共分离关系。用扩增Ds因子的引物,对F_2中45个卷叶抗性株进行PCR鉴定,都获得预期长度的Ds因子片段,进一步表明在这些卷叶的植株中都有T-DNA的插入;而30个正常叶敏感株都不能检测到Ds的特征片段。在以卷叶突变(R1-A2)为回交亲本的F_1B_1植株中,全部植株表现卷叶;在以中花11号为回交亲本的F_1B_1植株中,卷叶和正常叶植株的分离比为1:1。上述结果表明该卷叶突变是个显性突变,受一个基因所控制,且该基因的突变与T-DNA的插入有关。

一个水稻T-DNA插入类病斑突变体的初步研究

从T-DNA插入突变体中筛选到一个类病斑突变体AZT91,主要表现为生长缓慢、植株矮小、叶片出现条状褐斑,最后死亡。对突变体及其后代分离群体进行潮霉素抗性检测,证明该突变体是由T-DNA插入突变引起的,突变性状与T-DNA共分离。PCR和TAIL-PCR分析进一步证明了上述的观点。利用TAIL-PCR扩增了左边界侧翼序列,通过分析,初步推测该突变体可能是由于T-DNA插入后激活了单加氧酶基因的过量表达,破坏正常代谢途径,导致突变体死亡。该材料可用于水稻代谢调控机理的研究。

一个新的水稻生育期延迟T-DNA插入突变体

从水稻突变体库中筛选到一个生育期延迟突变体,主要表现为生育期延迟、植株矮化、叶色变深、叶角张大、根系变短。遗传分析表明,该突变体受1对隐性单基因控制。对突变体及其后代分离群体做Basta抗性检测,证实该突变体是由T-DNA插入引起的,突变性状与T-DNA共分离。PCR和Southern杂交结果进一步证实了上述观点。该材料可用于插入座位的基因克隆和生育期调控机理的研究。

水稻T-DNA插入氮营养缺陷型突变体的初步筛选

通过温室水培试验对根癌农杆菌介导的T-DNA随机插入构建的水稻突变体库的T1代2 173个家系进行筛选。以叶绿素SPAD值为指标,以苗期表观症状为参考指标,筛选到27个氮营养缺失的突变家系。对27个突变家系进行遗传分析、复筛及T2代鉴定,结果表明,编号955家系为氮营养缺陷型突变家系,且T2代能够稳定遗传。该材料通过进一步鉴定可用于分离、鉴定氮营养相关基因。

水稻抗白叶枯病T-DNA插入突变体侧翼序列的分离和分析

采用PCR-walking方法对水稻抗白叶枯病突变体G48的侧翼序列进行分析。通过特异性嵌套引物扩增和序列比对分析获得了该突变体T-DNA左、右边界侧翼序列,确定T-DNA插入水稻日本晴第三染色体clone OSJNBa0076E06(AC132215.1)位点上,左、右边界插入位点分别位于该克隆的第93 750、93 824碱基处。PCR-walking方法为T-DNA的侧翼序列分析提供了一种简单、高效的方法。

T-DNA插入产生的水稻小粒突变体遗传分析

[目的]研究水稻粒形突变体的遗传特性及其在水稻遗传改良中的作用。[方法]筛选水稻T-DNA插入纯合体,鉴定表型变异,通过表型突变的遗传分析及其与T-DNA插入共分离的检测,研究水稻表型突变的遗传特性。[结果]观察到1个粒形突变体T56。主要表现为粒长变短、粒宽变窄及千粒重降低;对该突变体进行遗传分析,分离群体出现野生型和突变体2种类型,其分离比符合3∶1,表明该突变体表型受1对隐性基因控制。突变体及其后代分离群体的Basta抗性检测和PCR分子检测结果表明,该突变体由T-DNA插入所引起,突变性状与T-DNA共分离。[结论]该材料可用于插入座位的基因克隆和水稻遗传改良的种质资源。

水稻PcG类基因OsEMF2b T-DNA插入杂合突变体的细胞学研究

采用石蜡切片法对水稻OsEMF2b的T-DNA插入杂合突变体的花器官形态、雌雄蕊发育和种子形成等过程进行了细胞学研究。结果表明,OsEMF2b杂合突变体花器官形态和各部分的数量有变异,但花药和胚珠发育以及花粉和胚囊的育性正常。OsEMF2b杂合突变体出现一定比例的受精卵不分裂、胚胎发育延迟、胚胎畸形,胚乳游离核不能细胞化和胚乳细胞退化解体等异常现象,从而导致其结实率明显低于野生型。OsEMF2b基因可能在水稻的花器官形成和种子发育过程中具有重要的调控作用。

外源生长激素对水稻T-DNA插入突变体褐飞虱抗性的影响及其农艺性状测定

【目的】分析外源生长激素对水稻T-DNA插入突变体褐飞虱抗性的影响,并测定其农艺性状,为突变基因介导的抗虫分子机理研究提供理论参考。【方法】以水稻受体中花11(ZH11)及其T-DNA插入突变体CF54为材料,利用三引物PCR鉴定出纯合突变株系,并用乙烯利(ET)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)对ZH11及其纯合突变株系进行处理,测定植株上褐飞虱的蜜露分泌量和虫体增重量。对ZH11及其纯合突变株系的株高、穗长、有效穗数、有效分蘖数、每穗实粒数和千粒重等农艺性状进行测定。【结果】从突变体CF54后代中共筛选出10个株系,其中纯合突变株系有2个,分别为CF54-6和CF54-10。经ET、SA和MeJA处理后ZH11及其纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的虫体增重量和蜜露分泌量较未处理对照显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01,下同)下降,但未处理对照间均无显著差异(P>0.05,下同)。经MeJA处理后,纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的虫体增重量和蜜露分泌量较ZH11显著下降,但经SA和ET处理的纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的蜜露分泌量和虫体增重量与ZH11无显著差异。纯合突变株系CF54-6和CF54-10的有效分蘖数、有效穗数和千粒重与ZH11无显著差异,但株高、穗长和每穗实粒数显著或极显著高于ZH11。【结论】ET、SA和MeJA 3种外源生长激素均能诱导水稻野生型及其纯合突变株系植株对褐飞虱的取食与生长发育产生抑制作用,尤其是MeJA抑制效果最佳,推测纯合突变株系抗虫性受茉莉酸(JA)信号途径的影响更大。T-DNA插入明显影响水稻植株的农艺性状。

T-DNA(Ds)插入产生的水稻卷叶突变的遗传分析

在筛选和鉴定水稻T-DNA(D s)插入纯合体的过程中,观察到1个叶片卷曲的突变体.对该突变体进行遗传分析表明,分离群体出现叶片卷曲和叶片正常2种植株类型,其分离比率为3∶1,符合1对基因的显性遗传.Basta抗性检测及PCR分子检测证实,该突变体是由单一T-DNA(D s)插入所引起的,突变性状与T-DNA(D s)共分离.该突变材料可用于插入座位的基因克隆.

T-DNA插入产生的水稻多分蘖突变的遗传分析

在筛选和鉴定水稻T-DNA(含Basta抗性基因Bar)插入纯合体的过程中,观察到一个多分蘖的突变体。其分离群体中多分蘖和正常分蘖两种植株类型的分离比率为3∶1,符合1对基因的显性遗传。Basta抗性检测、PCR分子检测及Southern杂交证实,该突变体是由单一T-DNA插入引起的,多分蘖性状与T-DNA共分离。该突变材料可用于插入座位的基因克隆。

水稻插入突变库构建研究进展

水稻是单子叶植物基因组研究的一种模式植物 ,其全基因组测序已经完成 ,在此基础上开展功能基因组的研究。水稻插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容 ,在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。水稻插入突变体库构建的方法有T DNA插入突变、Ac Ds系统插入突变、Tos1 7插入突变。

玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。

水稻OsABC1K3突变体鉴定及其对强光胁迫的响应

【目的】强光胁迫能够抑制植物光合作用,严重时造成光合器官破坏,影响作物生长和产量。以T-DNA插入突变体为材料,研究水稻ABC1(activity of bc1 complex)激酶基因Os ABC1K3响应强光胁迫的生理功能。【方法】根据水稻基因组注释数据库预测的Os ABC1K3不同转录本共有序列设计引物,采用3′RACE对Os ABC1K3可变剪接进行验证;从水稻T-DNA插入序列数据库中获得该基因的T-DNA插入突变体osabc1k3,通过加代繁殖和PCR检测取得纯合突变体,调查突变体株高、结实率、种子大小等农艺性状,采用Arnon法测定叶片色素含量,利用LI-6400便携式光合测定系统测定抽穗期旗叶光合速率,采用透射电镜分析叶绿体超微结构;将生长于300μmol·m^(-2)·s^(-1)光照强度下的野生型和突变体幼苗转移至800μmol·m^(-2)·s^(-1)光照强度进行强光处理,观察植株表型,分析叶绿体超微结构和叶绿素含量变化;用含20μmol·L^(-1)甲基紫精(MV)和0.1%吐温20的水溶液喷洒野生型和突变体幼苗叶片表面,以单独用0.1%吐温20喷洒的幼苗作为对照,观察叶片表型,测定处理后超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;采用实时荧光定量PCR分析突变体淀粉合成、叶绿体异戊二烯基脂合成及叶绿体ABC1激酶基因的表达。【结果】Os ABC1K3仅检测到一个转录本LOC_Os05g25840.3。osabc1k3突变体株高和结实率下降,种子变小,其中,粒宽下降了13.4%,粒厚下降了6.8%,千粒重下降了18.2%,而粒长与野生型无显著差异。突变体叶片叶绿素含量下降,而叶绿素a/b和类胡萝卜素含量高于对照。突变体叶绿体形态正常,但缺乏淀粉粒。光合活性分析表明,突变体叶片光合速率与野生型无显著差异。强光处理7 d后,突变体叶片发生黄化;9 d后,部分植株枯死。强光处理后突变体叶绿体类囊体结构紊乱,出现大量的空泡。进一步对叶绿素含量进行测定表明,突变体叶片叶绿素衰减程度显著高于对照。然而,MV处理后突变体叶片坏死程度、SOD活性及MDA含量与野生型无显著差异。此外,Os ABC1K3突变影响了叶片淀粉合成、叶绿体异戊二烯基脂合成及叶绿体ABC1激酶基因的表达。【结论】Os ABC1K3可能不参与水稻氧化胁迫的防御,而通过遗传控制的信号途径调控强光胁迫响应。

水稻穂顶部颖花退化T-DNA插入突变体的分子鉴定及表型特征分析

水稻穗部是重要的农艺性状之一,穂顶部颖花退化会导致水稻产量大幅下降。本研究对水稻穗退化T-DNA突变体进行分子鉴定和表型分析,旨在进一步探明水稻穗发育的调控机制。我们从水稻突变体库POSTECH RISD(Rice T-DNA Insertion Sequence Database)中筛选到了3个T-DNA插入突变体,paa1、paa2和paa3。这些突变体中T-DNA分别插入到水稻穂顶部颖花退化候选基因LOCOs04g56160的第1个内含子、第8个外显子和3′端非翻译区。分别在T-DNA插入位点两侧水稻基因组和T-DNA片段上共设计3条引物,利用PCR方法鉴定出paa1、paa2和paa3突变纯合体与杂合体。3个突变杂合体自交后代(T3)植株表型与基因型共分离分析结果显示,paa1及paa2植株的穗顶部颖花退化表型与基因型相吻合,而paa3植株的颖花发育正常。paa2与PAA-Hwa(LOCOs04g56160基因点突变体,表型为穗顶部颖花退化)杂交,F1代植株表现为穂顶部颖花退化。农艺性状调查结果表明,paa1及paa2与对照品种相比在株高、穗长、单株有效分蘖数等所有农艺性状上存在显著差异,然而paa3仅在部分农艺性状上表现差异。以上结果表明paa1和paa2为穗顶部颖花退化T-DNA插入突变体,LOCOs04g56160为水稻穗顶部颖花退化调控基因,该结果为水稻穗发育研究奠定了理论基础。

Ac/Ds标签系统与水稻功能基因组学

自2002年水稻基因组测序完成后,水稻功能基因组学研究正在成为水稻研究的重要内容。构建突变体库是研究功能基因组学的一条重要而有效的途径。利用外源的Ac/Ds(Activator/Dissociation)标签系统是构建插入突变体库较为理想的方法,经过多年发展完善,其在水稻中已有广泛的应用,但仍面临着一些需要解决的实际问题。文章对Ac/Ds标签系统的转座行为及其构建突变体库的问题和优点进行了综述,总结了近年来Ac/Ds标签系统在水稻中的研究进展,分析了利用Ac/Ds标签系统进行功能基因组学研究所面临的挑战。

水稻基因研究获进展将全面提升我国水稻国际竞争力

中科院院士、华中农业大学张启发教授主持的“水稻重要农艺性状相关功能基因研究”获得突破性进展。据了解，研究获得了具有自主知识产权和潜在应用价值的新基因有107个，发掘和鉴定与水稻重要农艺性状相关的新基因达到1200个。几年来，项目组创建了水稻大型突变体库及对应的数据库，已获得27万个独立转化子的T-DNA插入突变体；建立了水稻基因组表达谱分析平台，研制了全生育期cDNA芯片、全基因组寡聚核苷酸芯片、覆瓦式阵列芯片、第4号染色体特异芯片等各具特色的多套芯片；