日本医蛭摄食前后不同组织中水蛭素基因(hirudin)的时空表达模式

【目的】探究日本医蛭在不同摄食阶段、各个组织(唾液腺、肠、嗉囊、皮肤及精/卵巢)中水蛭素基因(hirudin)的时空表达模式,为水蛭药材的科学合理利用提供理论依据。【方法】基于水蛭唾液腺转录组数据筛选结果及基因克隆获得的水蛭素基因序列信息,利用实时荧光定量PCR方法,对水蛭关键活性成分的编码基因hirudin在不同摄食阶段、不同组织中的表达量进行检测分析,研究该基因的时空表达模式。【结果】水蛭素基因(hirudin)在日本医蛭的唾液腺、肠、嗉囊、皮肤及精/卵巢组织中均有表达,且在唾液腺中的表达量显著高于其他组织;Hirudin基因在不同摄食阶段的唾液腺组织中表达结果显示,摄食后第2天表达量显著升高,之后随着摄食时间的推延而呈下降趋势;Hirudin基因在嗉囊、肠中的表达量呈先升高后下降趋势,分别于摄食后第1、第2天达到最高,之后会随着停食时间延长呈下降趋势,尤其是在摄食后第7、第8天的表达量呈显著性降低;Hirudin基因在皮肤组织中也有表达,并随着停食时间的延长呈先升后降趋势,最高峰出现在摄食后第2天;在精/卵巢组织中,摄食期间hirudin基因的表达量最高,与其他摄食阶段的表达呈显著性差异。【结论】水蛭素基因(hirudin)在日本医蛭的唾液腺、肠、嗉囊、皮肤和精/卵巢组织中均有不同程度的表达,在唾液腺中的表达量显著高于其他组织。摄食行为及食物刺激可能影响水蛭素基因(hirudin)的表达,在不同摄食阶段的表达量存在显著差异。研究结果可为水蛭药材的科学采收加工、提取部位的科学选取、合理入药提供理论依据和技术支撑,对未来水蛭药材资源的可持续利用具有重要的参考价值。

基于3A组装的多拷贝基因策略优化重组水蛭素变体Ⅲ的生产

水蛭素变体Ⅲ(Hirudin varidantⅢ,Hv3)是一种从水蛭中提取的活性成分,在预防和治疗白内障方面具有潜在作用。为了制备足量Hv3用于进一步的临床前应用研究,该研究开发了一种在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中高效、稳定表达重组水蛭素变体Ⅲ(recombinant Hirudin varidantⅢ,Rhv3)的办法。首先,在C.glutamicum中构建含Ptac启动子和CspA信号肽的Rhv3分泌表达菌株,比较其在不同培养基中的表达情况。结果表明在BHI培养基中Rhv3活性最高,达到3.02×10^(3) ATU/L。为进一步提升Rhv3产量,通过核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)筛选,选用RBS1应用于Rhv3多拷贝菌株构建和表达。然后利用3A组装技术构建含不同信号肽和不同拷贝数的Rhv3分泌表达菌株进一步优化其产量。通过放大发酵培养,Rhv3产量达到1.89 g/L,活性达到10.91×10^(3) ATU/L。最后利用镍柱对Rhv3进行简单纯化,其纯度达到90%。该异源表达策略有效提高Rhv3表达量,为Rhv3的重组生产提供了一种质量可靠、低成本的表达体系。

毕赤酵母基因操作技术的改进及其在水蛭素表达中的应用

毕赤酵母是日益受到重视的基因工程受体菌 ,但是目前尚没有一种简便、高效的转化方法 ,也没有一种稳定、可靠的菌落PCR方法。本文通过在通常筛选重组子的MD培养基中增添 1mol/L山梨糖醇使毕赤酵母电穿孔转化效率提高 10倍以上。并比较系统地分析了其他影响电穿孔转化效率的因素 ,如毕赤酵母生长状况即OD60 0 ,不同的整合位点 (BglⅡ、SacⅠ、SalⅠ、StuⅠ ) ,及不同的毕赤酵母受体菌 (GS115和KM71)等。本文描述的转化方法所能达到的转化效率比目前大多数文献报道的效率要高 ,可使每微克质粒DNA产生的整合到受体菌染色体上的转化子述 2 80 0个 ;另外 ,我们经过一种冷热处理毕赤酵母菌落的方法使其细胞壁裂解 ,并改变通常PCR缓冲液的组成成分后 ,毕赤酵母菌落PCR方法几乎和大肠杆菌的操作一样简便可靠。借助本文所描述的电穿孔转化方法和菌落PCR方法 ,成功实现了水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达 ,表达量为每毫升培养上清 2 0 μg ,其生物活性达每毫升培养上清 82个国际单位。

水蛭素基因毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的 :构建水蛭素变异体HV1毕赤酵母分泌型表达载体 ,获得高拷贝稳定整合菌株 ,为大量获得重组水蛭素蛋白 ,进行功能研究及其临床应用奠定基础 .方法 :根据水蛭素HV1的氨基酸序列及毕赤酵母偏爱的密码子 ,设计HV1编码基因 ,分为 8条寡核苷酸片段进行DNA合成 ,经磷酸化、退火、连接和PCR扩增得到优化的HV1全长基因 ,测序结果正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游 ,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K ,得到pPIC9K HV1 ,SalI线性化后转化毕赤酵母GSM1 1 6 8,G4 1 8梯度筛选转化菌 ,PCR鉴定目的基因的整合 .结果 :获得了水蛭素毕赤酵母表达载体pPIC9K HV1 ,G4 1 8抗性筛选得到高拷贝菌株 ,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中 .结论 :成功构建了水蛭素HV1毕赤酵母表达载体 ,获得了高拷贝稳定整合菌株 。

水蛭素变异体I基因的合成及其在酵母中表达的初步研究

目的将水蛭素基因转入酵母系统中进行表达，以评价人工合成基因在真核系统中表达的可行性和探讨影响表达水平的因素。方法根据水蛭素变异体Ｉ（ＨＶ１）的氨基酸序列，选择酿酒酵母偏爱的密码子，设计了ＨＶ１基因。将ＨＶ１基因分１２个寡核苷酸片段，进行人工合成，并连接成一个完整的水蛭素基因。经ＰＣＲ扩增后，将扩增产物连到克隆载体ｐＢＳ－ＳＫ（＋）上并进行ＤＮＡ序列分析。用正确的ＨＶ１基因与酵母α因子信号肽基因相连，并一起插入酵母表达载体ｐＹＣ－ＤＥ，经鉴定表明，获得正确的重组表达质粒。将后者转入酿酒酵母ＢＪ１９９０细胞进行初步表达。结果在筛选出的阳性克隆的培养上清中，检测出的水蛭素活性为３０抗凝血酶单位（ＡＴＵ）／ｍｌ。所表达的量高于ＨＶ２在酵母中和ＨＶ１在原核系统的表达水平。Ｎ末端氨基酸序列与天然水蛭素一致。结论采用人工合成的ＨＶ１基因和较强的启动子在酵母中进行表达是一较好途径。

水蛭素基因的递归PCR合成和在大肠杆菌中的表达与分泌

水蛭素是凝血酶最强的特异抑制剂，可望成为预防和治疗各种血栓疾病的有效药物。根据医用水蛭（Ｈｉｒｕｄｏｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）头部水蛭素（ＨＶ－２）的氨基酸序列，通过递归ＰＣＲ，合成水蛭素基因，并重组到本实验室改建的大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ｏｍｐＡ－ＨＩ中，使水蛭素基因的编码序列直接位于大肠杆菌外膜蛋白Ａ信号肽序列的下游。转化大肠杆菌ＤＨ５α，筛选出重组体，经ＰＣＲ，限制酶切图谱和序列分析，结果表明所合成的水蛭素基因与设计完全一致。水蛭素基因在大肠杆菌中得到表达，重组水蛭素（ｒＨＶ－２）被分泌到细胞周质及培养基中，表达量占菌体蛋白的１９．８％，并且有明显抗凝血酶生物活性。经分离纯化，产物在质谱分析中显示基本为单一成分，分子量为６８９３．１Ｄａ，证明重组水蛭素在分泌过程得到正确加工。

水蛭素Ⅲ(HV_3)基因的合成,克隆与鉴定

根据水蛭素 (HV3)的氨基酸序列 ,设计并合成了六对 (共 12条 )互补寡核苷酸链。经退火配对、连接成完整的 HV3编码基因 (2 2 8bp) ,并克隆在载体 p UC18中。通过α-互补及小量抽提质粒酶切鉴定筛得阳性重组克隆 ,其中 ,p UCH33经正、反向引物测序鉴定 。

广东菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列测定

【目的】研究地理因素对水蛭素基因结构变异的影响。【方法】抽提广东菲牛蛭基因组DNA ,根据已发表的水蛭素基因设计一对引物 ,从基因组DNA扩增出一特异性的大约 70 0bp片段 ,再回收、克隆和测序。【结果】广东菲牛蛭水蛭素基因全长为 6 42bp ,基因有 4个外显子 ,被三个内含子隔开。与马尼拉菲牛蛭水蛭素基因Hm1、Hm2 的同源性分别为 90 %与和 88 6 %。【结论】地理因素会影响菲牛蛭水蛭素基因结构的变异。

水蛭素-RGD序列融合蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达

水蛭素是从医用水蛭唾液腺中分离纯化的一种多肽,分子量约为7 kD.它是天然存在的最专一有效的凝血酶抑制剂,无明显毒副作用,用量低,因此可作为抗栓药物用于治疗血栓性疾病[1～2].RGD序列是纤维蛋白原等粘附因子上以Arg-Gly-Asp为核心的小肽序列[3],通过与活化血小板上纤维蛋白原受体GPⅡb/Ⅲa结合而导致血小板聚集.因此外源RGD序列可通过竞争性结合该受体而阻断血小板的聚集,抑制血栓的形成[4].RGD序列与水蛭素融合可获得同时具有抗凝血酶和抗血小板聚集双功能的新型抗栓剂.本文首次报道重组水蛭素HV3与RGD序列融合蛋白基因克隆并在枯草芽孢杆菌中表达的结果.

水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞中的表达

设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因，并融会了ＲＧＤ３肽编码序列，通过连接、克隆、酶切筛选、ＤＮＡ序列分析，得到真核表达质粒ｐＡＰＲ－ＨＤ，表达质粒转染ＣＨＬ细胞，经Ｇ４１８筛选，获得表达克隆。结果：细胞培液中，重组水蛭素衍生物的活性达到１０ＡＴＵ／ｍｌ，并有抗血小板凝集作用。结论：水蛭素新突变体具有预防血栓性疾病的应用前景，但其表达水平和稳定性有待于进一步提高。

水蛭素的全基因合成及克隆

报道了水蛭素全基因的合成及克隆。根据已知水蛭素氨基酸序列及酵母菌体内蛋白质表达特性 ,设计了水蛭素的全基因序列 ,采用化学合成及酶学相结合的方法 ,合成了该基因片段 ,并逐段克隆至载体 pBS上 ,得到全长水蛭素基因。序列测定表明 ,克隆后DNA顺序同原设计序列。

水蛭素基因在酵母细胞中的分泌表达

报道了合成的水蛭素基因表达载体的构建 ,表达载体在酵母细胞中的表达 。

PCR方法在水蛭素基因克隆方面的新应用

目的应用PCR方法获得水蛭素基因。方法在传统PCR方法的基础上进行了改进 ,根据已知天然水蛭素基因序列 ,设计了一对 12 3nt且 3′端具有 15nt互补序列的单链DNA ,通过低温复性使其互补结合后 ,进行延伸反应 ,得到微量双链水蛭素基因。再以该基因作为模板设计一对引物 ,进行常规PCR扩增反应。结果获得水蛭素基因。结论此法对于获得象水蛭素基因这类序列已知、片段不太长 。

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞凋亡相关基因表达的影响

背景重组水蛭素Ⅲ（rHV3）对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞（LECs）有较好的保护作用，但其分子机制尚不清楚。目的探讨rHV3对半乳糖损伤的人LECs凋亡相关基因表达的影响。方法用本课题组构建的表达重组水蛭素工程菌，参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行水蛭素生物学活性的测定。将培养的人LECs分为3组，培养于含质量分数10％胎牛血清（FBS）的D／F12培养液作为正常组、用含125×10^-3mol／LD一半乳糖的D／F12培养液建立人LECs株SRAOI／04损伤模型为模型组，用2000U／ml（商品单位）rHV3加入部分损伤模型培养液中进行干预作为rHV3组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组人LECs内凋亡相关基因的表达，包括醛糖还原酶（AR）、bcl2、bax、p53基因mRNA的表达水平，各目的基因表达丰度用目的基因的吸光度（A）值与3一磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）A值的比值表达。结果与正常组比较，模型组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显高于对照组，差异均有统计学意义（t=3．90E一06、t=8．44E一04、t=5．15E一08，P〈0．叭），而水蛭素干预组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显低于模型组，差异均有统计学意义（t=5．90E一06、t=1．51E．04、t=3．42E一06，P〈0．01）。与正常组比较，模型组人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值明显降低，差异有统计学意义（t=1．86E一05，P〈O．01），与模型组相比，水蛭素干预后人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值显著提高，差异有统计学意义（t=8．56E一05，P〈0．01）。结论D一半乳糖导致人LECs损伤，rHV3可能通过抑制多元醇途径和线粒体介导的凋亡途径对人LECs起保护作用。

水蛭素基因DNA家族改组方法的建立

目的:运用DNA家族改组技术,增加改组分子库的多样性。方法:取水蛭素HV1、HV2、HV3基因等量混合,用DNaseⅠ消化,回收50bp左右的片段,再经无引物和有引物PCR扩增获得与原基因大小相同的改组分子,将其与载体连接获得水蛭素改组文库,DNA测序观察改组效果。结果:随机挑取3个克隆均为3种模板基因片段的杂合体,表明改组分子库多样性较好,改组方法较为成功。结论:水蛭素基因DNA家族改组方法的成功建立为进一步筛选高活性的水蛭素奠定了基础。

应用PCR定点诱变技术修正水蛭素Ⅲ(HV_3)化学合成基因

对水蛭素 (HV3 )化学合成基因克隆 No.4 2测序发现其编码区 12 5位碱基胞嘧啶 C缺失 ,采用 PCR定点诱变技术插入了缺失碱基胞嘧啶 C,恢复了正确阅读框架。修正基因经测序鉴定 ,其序列与设计的完全一致。

水蛭素基因在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化

目的：利用ＤＮＡ重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭素基因。方法：将水蛭素变体１的基因ＨＶ１克隆到ｐＥＺＺ３１８表达载体，转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９菌株，ＩＰＴＧ诱导表达，培养上清液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测，ｈＩｇＧ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化。结果：表达的融合蛋白相对分子质量为２０ｋＤ，表达上清的抗凝血酶活力为４７ＡＴＵ（ＡｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎＵｎｉｔ）／ｍｌ。

尿激酶B链cDNA及其与水蛭素12肽cDNA融合基因的构建

尿激酶原是一种溶栓效果好、副作用小的溶栓药物。研究证明尿激酶B链,即低分子量单链尿激酶,具有与尿激酶原相同的溶栓特性,对血栓溶解具有特异性,引起系统性出血的副作用较小,有可能成为一种较为理想的溶栓药物。它的氨基酸序列相当于尿激酶原的144～411aa,国外已通过缺失突变获得了它的结构基因,并在中国仓鼠卵巢细胞中表达成功。由于尿激酶B链分子量较小,且含尿激酶原的酶活功能区,

水蛭素12肽和尿激酶B链融合基因的构建与表达

尿激酶原是一种溶栓效果好、副作用小的溶栓药物。经研究证明尿激酶B链(即pro-UK的144-411aa)具有与尿激酶原相似的溶栓性,即对血栓溶解具有特异性,引起系统性出血副作用小。水蛭素是一种分离自医用水蛭、由65个氨基酸残基组成的单链多肽,能特异、高亲和性地抑制凝血酶的活性,研究证明它各方面的性能都优于肝素。近年来,通过多肽合成方式对水蛭素结构与功能进行了大量研究,确定水蛭素C端12肽是一个具有抗栓功能的结构片段。由于它对凝血酶的高度亲和性。