缺氧缺血对新生大鼠脑组织半胱氨酸蛋白水解酶激活因子蛋白表达的影响

目的探讨缺氧缺血(HI)对新生大鼠脑组织半胱氨酸蛋白水解酶激活因子(Smac)蛋白表达的影响。方法构建新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE)动物模型,实验动物随机分为HIE模型组、假手术组和正常对照组。在HI24、48、72、96h不同时间点取新生大鼠缺血侧大脑半球的海马组织,应用Westernblot技术测定其Smac蛋白水平。用比色法测定其Caspase-3活性。应用SPSS10.0软件进行单因素方差分析。结果HIE模型组大鼠海马组织在24、48、72、96h各时间点Smac蛋白水平均显著高于假手术和正常对照组(Pa<0.01),72h达到高峰,而假手术组和正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。HIE模型组72h时间点,海马组织Smac蛋白水平与Caspase-3活性呈显著正相关(r=0.7131P<0.05)。结论HI对新生大鼠脑组织的损害机制,可能涉及到Smac基因的蛋白表达。

脑出血与血浆血小板激活因子乙酰水解酶基因G994T突变的相关研究

目的探讨血浆血小板激活因子乙酰水解酶pPAF-AH基因G994T突变与中国人群脑出血发病的相关关系。方法利用等位基因特异性聚合酶链反应技术分析了150例原发性脑出血病人和150例非脑血管病对照组pPAF-AH基因的基因型位点频率。结果T等位基因在脑出血组的频率是3%,在对照组是4%,GT杂合子在脑出血组和对照组频率分别为6.8%和8.5%,两组差异无显著意义。没有发现突变型的纯合子。结论pPAF-AH基因G994T突变与中国人群的脑出血没有明显的相关关系。

人细胞内Ⅰ型血小板激活因子乙酰水解酶重组蛋白的构建、纯化及酶活性研究

目的构建人细胞内Ⅰ型血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)重组蛋白并加以纯化,利用不同底物研究酶活性。方法细胞内Ⅰ型PAF-AHβ亚基基因进行PCR扩增,目的基因经纯化、连接载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞构建重组蛋白,提取质粒行琼脂糖凝胶电泳、NdeⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定。鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞诱导蛋白表达和纯化,15%SDS-PAGE和Western blotting鉴定。分别以乙酸苯酯、l-O-hexadecyl-2-deoxy-2-thioacetyl-sn-glycero-3-phosphocholine(2-Thio PAF)和1-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidylcholine为底物(后两者为血浆型PAF-AH的商业化底物),应用分光光度法检测纯化后重组蛋白的酶活性,以血浆型PAF-AH作为阳性对照。结果人细胞内PAF-AHⅠ型β亚基重组蛋白构建正确,纯化后在大肠杆菌感受态细胞中诱导表达。与阳性对照血浆型PAF-AH比较,纯化后的重组蛋白同样能够水解乙酸苯酯,具有芳香酯酶活性;能快速水解2-Thio PAF,但不能水解1-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidyl-choline。结论成功构建人细胞内Ⅰ型PAF-AH重组蛋白,其对血浆型PAF-AH的两个商业化底物具有完全不同的水解能力,以此可快速区分细胞内和血浆型PAF-AH。

血小板激活因子与精子获能

血小板激活因子与其受体结合后 ,能明显促进精子的获能过程 ,血小板激活因子乙酰水解酶降解血小板激活因子抑制精子的获能。

SARS-CoV-2入胞机制的研究进展

新冠病毒(SARS-CoV-2)大流行对全球的公共卫生及经济造成了前所未有的影响,有关它的研究也成为了当前科学界最热门的领域之一;作为病毒感染的首要环节,SARS-CoV-2的入胞机制更成为人们认识病毒行为、研究阻断病毒入侵途径的关注点。本文对SARS-CoV-2进入细胞过程中涉及的蛋白、受体、辅助因子、入胞过程中的S蛋白构象变化、入胞途径等进行了全面综述,以期展示SARS-CoV-2的入胞条件与动态图谱,为明晰病毒与细胞的相互作用、研制疫苗或治疗药物奠定基础。

PAFAH1B3表达水平与多发性骨髓瘤患者自体造血干细胞移植后疾病进展风险的相关性

目的:探讨接受自体造血干细胞移植(AHSCT)治疗的多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓CD138^(+)细胞中血小板激活因子乙酰水解酶1B3(platelet-activating factor acetylhydrolase 1B3,PAFAH1B3)基因表达水平与2年内预后之间的相关性。方法:选取2014年5月至2019年5月间于南通大学第一、第二附属医院就诊的147例行AHSCT治疗的MM患者作为研究对象,检测患者骨髓CD138^(+)细胞中PAFAH1B3 mRNA的表达水平,并将随访2年间疾病进展或死亡者纳入进展组,其余纳入预后良好组。比较两组患者的临床资料和PAFAH1B3 mRNA表达水平,以入组患者PAFAH1B3 mRNA表达水平中位数为界将患者分为PAFAH1B3高表达组和低表达组,采用Kaplan-Meier法比较两组患者的无进展生存率(PFSR)。应用单因素分析和多因素COX回归分析法分析患者2年内预后的相关因素。结果:随访结束时共有13/147例患者失访,最终进展组纳入44例,预后良好组纳入90例。进展组年龄高于预后良好组,移植后达CR^(+)VGPR患者比例低于预后良好组,两组ISS分期例数分布差异有统计学意义(均P<0.05);进展组PAFAH1B3 mRNA表达水平和LDH>250 U/L患者比例均高于预后良好组,PLT值低于预后良好组(均P<0.05);PAFAH1B3高表达组2年PFSR显著低于低表达组(log rankχ^(2)=8.167,P=0.004);LDH>250 U/L(HR=3.389,P=0.010)、PAFAH1B3 mRNA表达水平(HR=50.561,P=0.001)和ISSⅢ期(HR=1.000,P=0.003)为患者预后的独立危险因素,ISSⅠ期(HR=0.133,P=0.001)为患者预后的独立保护因素。结论:接受AHSCT治疗的MM患者骨髓CD138^(+)细胞中PAFAH1B3 mRNA表达水平与预后相关,检测PAFAH1B3 mRNA表达水平对预测患者的PFSR和预后分层具有一定意义。

肥大细胞类胰蛋白酶对人肾成纤维细胞MCP-1和PAR-2表达的影响

目的进一步探讨肥大细胞类胰蛋白酶在慢性肾组织纤维化中的作用。方法采用胶原酶消化法从肾肿瘤患者切除的肾标本获取肾组织(经光镜检查,无肿瘤细胞浸润)分离、培养人肾间质成纤维细胞。应用细胞形态学、免疫细胞化学鉴定培养的细胞为人肾成纤维细胞后,分组进行下一步实验。应用RT PCR检测单核细胞趋化因子1(MCP1)和蛋白水解酶激活受体2(PAR2)mRNA的表达。结果成功培养了人肾成纤维细胞,肥大细胞类胰蛋白酶(10～500ng/ml)可促进肾间质成纤维细胞PAR2和MCP1mRNA的表达,且依赖于肝素的存在。蛋白水解酶抑制剂苯甲脒(200μmol/L)能抑制类胰蛋白酶的上述效应。TGFβ中和抗体不影响上述效应。结论肥大细胞类胰蛋白酶可能通过PAR2直接作用于肾间质成纤维细胞,促进人肾成纤维细胞表达MCP1,参与肾间质纤维化过程。

小麦ArfGAP基因的克隆、半定量RT-PCR分析及原核表达

为明确小麦ArfGAP基因在非生物胁迫中所行使的功能,采用电子克隆技术分离普通小麦ArfGAP基因后对其在不同非生物胁迫下的表达特性进行了分析,并在大肠杆菌中表达了该基因。结果表明,从扬麦18号中克隆得到的TaArfGAP基因ORF全长为2 121bp。生物信息学分析表明,TaArfGAP蛋白氨基端方向存在一个典型的ArfGAP蛋白结构域,在亲缘关系上与山羊草、乌拉尔图小麦和短柄草较近,而与甘蓝等作物关系较远。半定量RT-PCR分析表明,TaArfGAP基因在干旱、PEG和NaCl胁迫下显著上调表达,但在高温条件下则显著下调表达。SDS-PAGE检测结果表明,IPTG终浓度为0.8~1.0mmol·L-1、诱导温度为24℃及诱导时间为10h时,在分子量大小为81kD左右可以得到较大的可溶性表达蛋白量,且与预期结果一致,说明TaArfGAP基因在原核表达体系中成功表达。

Smac蛋白促进肿瘤细胞凋亡作用的研究进展

细胞凋亡失控是肿瘤的一个标志,与多种恶性肿瘤的发生和发展相关,肿瘤细胞内肿瘤凋亡抑制蛋白(IAP)家族的表达上调正是肿瘤细胞产生辐射抗性和耐药性的基础。Smac来源于线粒体,能特异地作用于IAP家族的XIAP,解除其凋亡抑制作用,从而激活半胱氨酸蛋白酶,发挥其促细胞凋亡作用,对肿瘤细胞有辐射和化疗増敏作用,可能成为肿瘤治疗的新方法和新途径,是目前相关领域的研究热点。

大熊猫精浆中PAF-AH和GOT水平与精液质量的关系

本研究检测了大熊猫精浆血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)和谷草转氨酶(GOT)活性,初步探讨了这些物质与大熊猫精液质量的关系。结果显示,大熊猫精浆存在PAF-AH和GOT,其平均水平分别为(56.76±60.86)mmol.min-1.mL-1和(1 948.9±774.0)IU/L,PAF-AH含量高低与精子活力呈高度负相关(R=-0.73,P<0.001),与精子运动状态呈负相关(R=-0.58,P<0.05);GOT含量高低与精子活力显著负相关(R=-0.66,P<0.01)。这些结果表明,大熊猫精浆PAF-AH和GOT活性之高低可作为评价大熊猫精液质量的参照指标。

X连锁凋亡抑制蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂对血管瘤演变的作用

目的 探讨X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂（Smac）在小儿血管瘤消退中的作用.方法 收集未经其他治疗、单纯手术切除并经病理诊断为血管瘤的标本31例,结合Mulliken分类法与增殖细胞核抗原（PCNA）表达对血管瘤进行分类和分期,采用免疫组织化学方法检测XIAP、Smac在血管瘤组织中的表达.结果 18例增殖期血管瘤XIAP、Srnac的积分光密度分别为2421.03±792.91,472.05±182.16;13例退化期血管瘤XIAP、Smac的积分光密度分别为443.24±105.15,2074.10±320.41.血管瘤增殖期Smac的积分光密度明显低于消退期,差异有显著性（P＜0.01）;血管瘤增殖期XIAP的积分光密度明显高于消退期,差异有显著性（P＜0.01）;XIAP与Smac的表达之间呈负相关关系（r=-0.753,P＜0.01）.结论 XIAP、Srmac相互作用可能是导致了血管瘤消退原因之一.

类风湿性关节炎患者高凝血状态与核因子κB活化及致炎因子增加有关

目的基于核因子κB(NF-κB)信号转导通路探讨类风湿性关节炎(RA)患者高凝血状态的机制。方法选取RA患者35例,健康志愿者20例。ELISA检测两组血清中白细胞介素10(IL-10)、IL-6、IL-4、IL-17、NF-κB激活子1(Act1)、p50、p65、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、血小板激活因子(PAF)、PAF-乙酰水解酶(PAF-AH)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体水平,全自动血细胞分析仪检测血小板(PLT)数量,魏氏法检测血沉(ESR),全自动生化仪检测C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF),全自动凝血仪检测D-二聚体(D-D)、纤维蛋白原(FBG)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶原时间(APTT)水平;同时半定量反转录PCR检测Act1、p65、p50、IκBα、IκB激酶α(IKKα)mRNA水平,Western blot法检测p65、p50、IκBα蛋白水平。采用Spearman分析RA患者外周血中凝血纤溶指标与细胞因子、NF-κB、活动性指标以及临床症状体征之间的相关性。结果与正常组相比,RA患者外周血中D-D、FBG、PLT明显升高,TT缩短,APTT和PT无明显改变;RA患者血清IL-4、IL-10、PAF-AH的水平明显降低,IL-6、IL-17、Act1、p50、p65、IκBα、IKKα,PAF明显升高;相关性分析显示,RA患者外周血中凝血纤溶指标与细胞因子、NF-κB、活动性指标以及临床症状体征均明显相关。结论 RA患者体内普遍存在高凝状态,并与炎性因子、活动性指标及NF-κB异常活化密切相关。

Survivin、Smac/DIABLO表达水平与胎膜早破的关系分析

目的研究Survivin、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂(Smac)/DIABLO与胎膜早破的关系。方法选取深圳市龙华新区人民医院收治的30例胎膜早破孕妇作为观察组,同期选取30例体检正常的孕妇作为对照组。两组均采集孕妇胎膜破口部位组织,采用免疫组织生化方法测定胎膜组织中Survivin及Smac/DIABLO表达水平。结果观察组患者胎膜组织细胞Survivin及Smac/DIABLO蛋白阳性检出率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Survivin及Smac/DIABLO表达水平与孕妇胎膜早破关系密切,可以较准确地反应胎膜早破的情况,可为临床诊断提高依据。

B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白基因过表达对人脑胶质瘤U251细胞株Smac/DIABLO表达的影响

目的 观察B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白（bax）基因过表达对人脑胶质瘤U251细胞第二线粒体来源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂或低等电点的凋亡蛋白抑制剂家族直接结合蛋白（Smac/DIABLO）表达的影响,并探讨其机制.方法 采用脂质体Lipofectamine2000转染,将携带人bax基因的表达质粒转入人脑胶质瘤U251细胞株中,同时设转染pEGFP空载体和未转染的U251细胞为对照.用Western blot法检测3组细胞中bax、Smac/DIABLO蛋白的表达,用免疫荧光法检测Smac/DIABLO蛋白在细胞中的分布.结果 bax蛋白表达水平在转染外源性bax基因组为0.82±0.12,相较于未转染组（0.35±0.05）、转染pEGFP组（0.32±0.09）显著增高（P＜0.05）.Smac/DIABLO蛋白表达在转染bax组为1.09±0.16,相较于未转染组（0.62±0.10）、转染pEGFP组（0.70 ±0.20）表达上调（P＜0.05）.bax、Smac在未转染和转染pEGFP细胞中表达差异无统计学意义（P＞0.05）.免疫荧光显示Smac/DIABLO主要分布于胞质.结论 外源性bax基因转入人脑胶质瘤细胞中并过表达,能够上调Smac/DIABLO蛋白表达.