山羊子宫内膜基质细胞永生化研究

将真核表达质粒pCI-neo-hTERT通过DNA转染技术导入山羊子宫内膜基质细胞（ESCs）,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定、生长特性及E2、P4等性腺激素的反应性测定。结果,传至2代的山羊ESCs经转染pCI-neo-hTERT,G418筛选2~3周后,抗性克隆形成,滤纸片法转移,扩增并连续培养,共获得5个细胞克隆,扩大培养后的细胞呈典型的长梭形和三角形,相互平行排列成束,与原代培养形态一致。转染后细胞有较高的端粒酶活性,细胞增殖加速,传代时间缩短,传至50代仍稳定增殖。波形蛋白检测阳性,角蛋白检测阴性,具有转染前山羊子宫内膜基质细胞特性。雌激素（100 nmol.L-1）和少量孕激素（10 nmol.L-1）对转染后基质细胞增殖有促进作用。获得了永生化的ESCs,为子宫内膜细胞体外研究奠定了基础。

人子宫内膜异位症异位腺上皮永生化细胞系的建立

目的:建立人子宫内膜异位症(EMs)的异位腺上皮永生化细胞系,为进一步深入研究EMs奠定基础。方法:取人EMs异位病灶组织进行原代培养,用质粒PCD2SV40T转染原代细胞,G418筛选14天后获得抗性克隆。将抗性克隆传代培养,用免疫细胞化学、RT-PCR、细胞计数、核型分析及裸鼠成瘤实验等对细胞系进行鉴定。结果:建立了一株传代超过50代的永生化细胞系,命名为hEM5B2。该细胞系具有腺上皮细胞形态,细胞角蛋白与波形蛋白阳性,抗成纤维细胞抗体阴性,雌激素受体α和β亚型(ER-α,ER-β)及孕激素受体(PR)阳性,细胞倍增时间64.8h。核型分析显示,染色体众数为78～123,为多倍体核型;观察1个月裸鼠成瘤实验显示未成瘤。结论:hEM5B2细胞系是一株人EMs异位腺上皮永生化细胞系,可作为细胞模型用于EMs的体外实验研究。

山羊子宫内膜腺上皮细胞的分离培养和鉴定

为了探讨山羊子宫内膜腺上皮细胞的分离、生长条件以及纯度鉴定，通过2g／L的Ⅰ型胶原酶置于水浴消化4h，200目的滤网过滤后进行低速离心，收集沉淀物，沉降洗涤3～5次，将细胞移至24孔培养板置37℃细胞培养箱中进行培养。12h后开始贴壁生长，腺团开始向外部扩散，生长2～3d，细胞扩散并出现明显的铺路石状，4～5d腺团基本扩散开来并呈一定走向继续生长。经免疫组织化学方法进行细胞染色，细胞表达角蛋白的阳性率达90％以上。

山羊子宫内膜基质细胞的分离培养及鉴定

对山羊子宫内膜基质细胞进行分离与体外培养,研究其生长特性,并对其进行免疫细胞化学染色鉴定。结果表明,山羊子宫内膜在37℃条件下,以2 g／L的胶原酶Ⅰ型消化3～4 h效果最好;采用过滤—低速离心—沉降相结合的方法分离山羊子宫内膜基质细胞效果较好,所得细胞在培养后0．5 h开始贴壁,培养12 h后,可见梭形和多角形2种形态的细胞,3～4 d呈网状铺满皿底,有明显的重叠生长现象;免疫细胞化学染色显示这2种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达95％以上,不表达角蛋白。说明采用本文所述的消化和分离方法可获得高纯度的子宫内膜基质细胞。

复方益母生化散对奶牛子宫内膜细胞CYP450表达和免疫功能的影响

【目的】探讨复方益母生化散对奶牛子宫内膜炎的作用机理。【方法】体外实验:分离奶牛子宫内膜细胞,细菌脂多糖(LPS)诱导子宫内膜细胞炎症模型,复方益母生化散处理子宫内膜炎症细胞48h、72h,Western blotting法检测CYP450的表达;体内实验:复方益母生化散栓剂治疗患有子宫内膜炎的奶牛,检测血清中IgG、IgA含量的变化。【结果】复方益母生化散处理后,子宫内膜炎症细胞CYP450的表达随复方益母生化散剂量的增加而呈升高的趋势,血清中IgG、IgA的含量与对照组相比明显升高。【结论】2000μg·mL-1的复方益母生化散作用奶牛子宫内膜炎症细胞48h,CYP450的表达最明显。

硒对山羊子宫内膜淋巴细胞体外活化作用及对其分泌细胞因子的影响

分离妊娠山羊子宫内膜淋巴细胞（Endometrial lymphocyte，EML）后，分别加入4、8、12、16mg／L的亚硒酸钠进行体外培养，探讨硒对EML的活化作用及其对分泌细胞因子IL-2、IL-4、TGFβ1及TGFβ2的影响。结果显示，8～16mg／L的亚硒酸钠可显著地促进山羊EML的体外活化（P〈0．01），并呈剂量依赖性。EML活化后，对IL-2的分泌呈微弱的促进作用；对IL-4、TGFβ1、TGFβ2的分泌有显著的促进作用。

CD58对山羊子宫内膜γδT细胞活化及其分泌TGF-βs的作用

用MTT法测定了CD58对山羊妊娠不同时期子宫内膜γδT细胞的活化作用,同时应用ELISA法,分别测定了山羊妊娠第30天的子宫局部γδT细胞在体外活化后分泌TGF-βs的特性。结果表明,CD58可以剂量依赖的方式刺激γδT细胞活化,在试验剂量范围内,1.25mg/LCD58刺激作用最强。同时,各刺激因素的作用在妊娠的不同时期也存在差异,在相同剂量CD58的刺激下,γδT细胞的活化程度自妊娠第20天起至妊娠3个月,依次升高,4个月又呈下降趋势。PHA-P和CD58均可刺激子宫内膜γδT细胞分泌TGF-β1和TGF-β2,其分泌量与细胞的活化程度一致。与目前已研究的小鼠等动物不同,TGF-β1的分泌量显著高于TGF-β2。

性腺激素对山羊子宫内膜细胞TNF-α与TGF-β分泌活性的影响

为探讨性腺激素对山羊子宫内膜细胞分泌活性的影响,基于套皿培养技术构建永生化山羊子宫内膜上皮细胞(EEC)与基质细胞(ESC)共培养体外研究模型,通过ELISA检测性腺激素E2和/或P4对单独培养EEC中TNF-α与TGF-β分泌活性的调节作用以及ESC对该培养体系的影响。结果显示:与未加激素对照组相比,单独或混合添加E2和P4均可显著增加单独培养EEC向顶端分泌TNF-α水平(P<0.05),而对细胞基底端TNF-α分泌活性影响不显著;E2单独作用较对照组显著降低EEC向细胞顶端分泌TGF-β水平(P<0.05),P4单独或与E2共同作用下则主要对单独培养EEC顶端及基底端分泌TGF-β水平具有显著增强作用(P<0.05)。对于EEC-ESC共培养细胞模式,E2和/或P4显著降低EEC顶端和基底端TNF-α分泌水平(P<0.05);EEC顶端TGF-β分泌水平在E2和/或P4作用下显著降低(P<0.05),而EEC基底端TGF-β分泌水平不受激素作用所影响。激素对单独培养及与ESC共培养模式下的极化EEC顶端及基底端TNF-α与TGF-β分泌水平的差异,提示ESC对激素作用下山羊子宫内膜上皮细胞分泌方向及分泌水平的重要调节作用。

小鼠子宫内膜细胞对小鼠脾脏淋巴细胞和山羊PBMC转化与分泌活性的影响

【目的】探索小鼠子宫内膜细胞培养上清液对小鼠脾脏淋巴细胞和山羊外周血单个核细胞(Peripheral Blood Monouclear Cells,PBMC)的转化及分泌活性的影响。【方法】采用噻唑蓝(MTT)比色法和酶联免疫吸附测定法(ELISA),分别研究小鼠子宫内膜上皮细胞(Endometrial Epithelial Cells,EECs)和基质细胞(Endometrial Stro-mal Cells,ESCs)培养上清液,对离体培养的小鼠脾脏淋巴细胞、山羊外周血单个核细胞(Peripheral Blood MonouclearCells,PBMC)的增殖转化及白细胞介素2(Interleukin-2,IL-2)和白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)分泌活性的影响。【结果】小鼠子宫内膜基质细胞和上皮细胞培养上清液,均可无种属差异地刺激小鼠脾脏淋巴细胞和山羊PBMC的增殖转化,同时抑制植物血球凝素(Plant hemaggluti min PHA-P)诱导的小鼠淋巴细胞和山羊PBMC分泌IL-2的活性,但对PHA-P诱导的IL-4分泌有促进或协同作用。【结论】EECs和ESCs通过影响小鼠脾脏淋巴细胞和山羊PB-MC的增殖转化与分泌活性,优势活化Th2型淋巴细胞,在子宫局部免疫调节中发挥重要作用。

崂山奶山羊永生化骨髓间充质干细胞的诱导分化研究

为研究崂山奶山羊永生化骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化潜能,采用P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs进行体外成脂和成神经诱导分化。结果显示,当细胞传至P30代时,TERT-BMSCs生长旺盛;在成脂诱导后,P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs均能观察到细胞中透明脂滴的形成,油红O染料染色后可见脂滴被染成红色;在成神经诱导后,P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs均能形成树突样或三角形的形态,甲苯胺蓝染色后可观察到细胞中尼氏体的存在。综上提示,永生化的崂山奶山羊BMSCs在多次传代后仍具有较强的多向诱导分化能力,这为永生化MSCs的广泛应用提供了理论依据。

崂山奶山羊骨髓间充质干细胞永生化细胞系的建立

为建立崂山奶山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)永生化细胞系,将已构建的pcDNA3.1-EGFPTERT转入崂山奶山羊BMSCs中,利用含G418的培养基筛选获得稳定转染的TERT-BMSCs;通过多次传代,测定其生长曲线;选取高代次TERT-BMSCs的分裂中期相的细胞,检测其染色体及核型的稳定性。结果表明,转入TERT基因的崂山奶山羊BMSCs能够稳定表达该基因,其生长曲线呈"S"形;在多次传代后,P40代细胞的核型正常率仍能达到88.24%。综上提示,转染得到的TERT-BMSCs具有良好的生长状态,其细胞生长稳定,符合永生化细胞特征,为间充质干细胞应用于组织修复及基因工程种子细胞的制备提供了理论基础。

山羊子宫内膜细胞的体外培养技术及其应用研究进展

对目前现有的山羊子宫内膜细胞的体外培养技术及其应用的研究进展进行了综述,旨在为该技术在山羊上的进一步应用提供参考。

山羊子宫内膜细胞与性腺激素对uNK细胞分泌活性的调节作用

为探讨山羊子宫内膜细胞和性腺激素对子宫自然杀伤(uNK)细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)和γ-干扰素(IFN-γ)含量的影响。本研究以永生化山羊子宫内膜基质细胞(ESC)和上皮细胞(EEC)为体外研究模型,通过ELISA法检测子宫内膜细胞和性腺激素(E2和P4)对uNK细胞分泌VEGF和IFN-γ含量的影响。结果显示,在uNK细胞与EEC共培养时,雌激素E2单独或与P4共同作用可显著抑制uNK细胞中IFN-γ和VEGF分泌水平(P<0.05),而P4单独作用不显著;而当uNK细胞与ESC共培养时,孕酮P4单独或与E2共同作用可显著增强IFN-γ在uNK细胞中的分泌水平(P<0.05),而E2单独或与P4共同作用可显著抑制VEGF分泌水平(P<0.05)。研究结果表明性腺激素对与EEC或ESC共培养的uNK细胞分泌水平具有不同程度的调节作用。

玉米赤霉烯酮诱导山羊子宫内膜基质细胞凋亡的研究

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是由镰刀菌产生的一种霉菌毒素,具有细胞毒性和雌激素活性,会对生殖系统、泌尿系统和消化系统等产生严重毒性影响。目前,ZEN对山羊子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)凋亡的潜在作用仍不清楚。本研究通过体外培养山羊永生化ESCs,采用CCK-8和流式细胞术检测ZEN对山羊ESCs增殖和凋亡的影响;应用Real-time PCR和Western blot技术检测内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和凋亡关键基因的变化,探讨ZEN是否通过ERS影响山羊ESCs的增殖与凋亡。结果显示,ZEN抑制了山羊ESCs的增殖过程并呈剂量依赖性关系。随着ZEN剂量的增加,山羊ESCs的凋亡比例显著上升。ZEN剂量依赖性地上调了Caspase-8、Caspase-9及Bax/Bcl-2 mRNA表达水平。ZEN显著上调了ERS标志分子GRP78和CHOP mRNA和蛋白的表达水平,同时,ERS关键分子ATF6、PERK和IRE1 mRNA表达水平显著增加,并且ZEN对IRE1通路的影响更为显著。添加ERS特异性抑制剂4-PBA和IRE1特异性抑制剂Irestatin 9389均可显著降低ZEN对ESCs增殖的抑制作用。综上表明,ZEN可以通过ERS通路调控山羊ESCs的凋亡进程。

山羊CREBZF蛋白两种亚型过表达载体的构建及其对子宫内膜上皮细胞凋亡的影响

旨在构建编码山羊CREBZF蛋白2种亚型(长亚型SMILE和短亚型Zhangfei)基因的过表达载体,并初步探究CREBZF对山羊子宫内膜上皮细胞(gEECs)凋亡的影响。本研究针对编码山羊CREBZF不同亚型的基因CDS区分别设计引物,分段进行PCR扩增;运用无缝克隆技术将所获得各目的基因片段与线性化pcDNA3.1(+)载体连接,构建pcDNA3.1(+)-SMILE和pcDNA3.1(+)-Zhangfei重组过表达载体,通过双酶切和测序进行鉴定;转染过表达载体至gEECs,提取总RNA和蛋白,通过qRT-PCR和Western blot验证过表达效率;应用流式细胞术检测过表达SMILE和Zhangfei对gEECs凋亡率的影响。PCR、双酶切显示各目的条带大小正确;测序显示目的片段与NCBI基因库中山羊CREBZF的预测序列一致性为100%;转染过表达载体后,gEECs中SMILE与Zhangfei在转录和翻译水平的表达量均显著增加,并发现SMILE可能在翻译后自身被修饰;空载体组细胞凋亡率为8.45%;转染pcDNA3.1(+)-SMILE组凋亡率显著上升至12.41%(P<0.01);转染pcDNA3.1(+)-Zhangfei组凋亡率上升至9.83%,但相较于空载体组统计学差异不显著;结果提示,CREBZF可能调控gEECs的凋亡进程。本研究将目的基因分段克隆与无缝克隆技术联用,构建了上述2种过表达载体,为进一步探究CREBZF在反刍动物子宫内膜上皮细胞周期性变化中的作用奠定基础。

雌二醇和孕酮体外诱导山羊子宫内膜上皮细胞中MUC1表达的研究

为了对山羊子宫内膜上皮细胞不同发情时期MUC1基因与蛋白水平的表达趋势进行分析,试验采用浓度为1×10^(-5 )mg/mL孕酮、1×10^(-7 )mg/mL雌二醇培养子宫内膜上皮细胞48 h,利用激光共聚焦显微技术、荧光定量PCR技术及蛋白免疫印迹法分析比较MUC1的表达差异。结果表明:MUC1蛋白主要在子宫内膜上皮细胞的细胞质中表达;MUC1 mRNA相对表达量呈先上升后下降的趋势;MUC1蛋白相对表达量呈先上升后下降的趋势,且发情中期MUC1蛋白相对表达量较高,发情间期MUC1蛋白相对表达量最低(P<0.05)。说明在不同发情时期山羊子宫内膜上皮细胞中MUC1的转录翻译水平变化存在规律,且主要受类固醇激素影响。

手术致奶山羊子宫内膜炎对生命体征及血液相关指标的影响

奶牛产后子宫感染严重制约着畜牧业的发展，围绕奶牛子宫内膜炎发病机制的研究是奶牛疾病研究的热点，但目前国内外的研究多以临床自然发病病例为研究对象，研究分娩前后细胞因子和急性期蛋白等理化指标的变化与子宫内膜炎发生的关系，未见利用奶山羊模型对该疾病的发生、发展及先天性免疫机制进行系统研究的报道。奶牛与奶山羊同为反刍动物，在采食特性、生理生化指标、解剖特点等方面虽有不同，但具有一定的相似性，而且山羊体形小、价格低，便于试验管理和操作。本研究的目的在于建立山羊子宫内膜炎病理模型，保证其发病程度和症状的一致，从而为研究该病的诊断、治疗及防治方法创造良好条件，并可以进行针对性的药物治疗试验，为筛选和验证治疗药物提供一种可靠的手段。

五加生化胶囊联合屈螺酮炔雌醇对人工流产术后子宫内膜厚度、卵巢功能及炎性因子影响

目的分析五加生化胶囊联合屈螺酮炔雌醇对人工流产术后子宫内膜厚度、卵巢功能及炎性因子的影响。方法选取2018年1月—2020年1月行人工流产术者94例,根据术后药物治疗方案不同将其分为观察组与对照组,每组47例。观察组术后予以五加生化胶囊联合屈螺酮炔雌醇,对照组术后予以屈螺酮炔雌醇。观察两组阴道出血时间、月经复潮时间、阴道出血量及并发症发生情况,比较治疗前和治疗7 d后子宫内膜厚度、黄体生成激素(LH)、雌二醇(E_(2))、促卵泡激素(FSH)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10、全血高切黏度、全血低切黏度和纤维蛋白原水平。结果观察组阴道出血时间、月经复潮时间均短于对照组,阴道出血量少于对照组(P<0.01)。治疗7 d后,观察组E_(2)、IL-10水平高于对照组,FSH、LH、IL-6、TNF-α、全血高切黏度、全血低切黏度、纤维蛋白原水平低于对照组,子宫内膜厚度大于对照组(P<0.01)。观察组并发症总发生率低于对照组(P<0.05)。结论五加生化胶囊联合屈螺酮炔雌醇可促进人工流产术后子宫内膜复旧,减轻创伤性操作对卵巢功能的影响,这可能与该方案的抗炎、改善血液流变学等作用相关。

山羊子宫内膜上皮细胞转染pCI-neo-hTERT质粒后的永生化

为获得大量的、具有高度同一性和表型功能正常的山羊子宫内膜上皮细胞(EEC),本试验将含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的真核表达质粒pCI-neo-hT ERT导入原代山羊EEC中,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定,利用免疫细胞化学方法检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达情况,探讨转染后细胞的生长特性。结果显示,转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈明显铺路石状,与原代细胞形态一致,具有接触抑制性;角蛋白检测阳性;细胞具有较高的端粒酶活性,目前已传至50代仍稳定增殖;100nmol/L的雌二醇(E2)可促进该细胞的增殖;50,100nmol/L的孕酮(P4)可明显抑制该细胞的增殖。这表明hTERT导入山羊EEC后,可使其重建端粒酶活性,从而获得大量的、具有高度同一性和表型正常的细胞。