不同代数永生化支气管上皮细胞中蛋白质的分布特征

目的:采用凝胶分离、高效液相色谱/质谱联用技术对不同代数的永生化支气管上皮细胞加以研究,说明不同代数导致的蛋白质分布变化。方法:实验在大连化学物理研究所生物技术部生物分子高效分离与表征实验室完成。实验所用的样品MP49和MP188来自中国医学科学院,由程书钧院士友情提供。M细胞是中国医学科学院自行建立的永生化支气管上皮细胞系的第49代和188代,利用该实验室配制的无血清培养基进行常规细胞培养,收集培养液。采用凝胶分离、高效液相色谱/质谱联用技术对分泌到培养液中的分泌蛋白质进行特征分析。结果:MP49的蛋白的相对分子质量分布较广,几乎在10000～100000范围内都有蛋白质分布;MP188的蛋白主要集中在高分子量范围和低分子量范围内(Mr>60000,<10000)。MP49酶解产物中疏水性肽明显多于MP188。结论:在支气管上皮的恶性演变过程中寻找可能的癌症早期诊断蛋白质标记物,从亲水性较强的高分子量或低分子量蛋白质入手可能会得到更好的结果。

挥发性有机物对永生化支气管上皮细胞的急性毒性

目的评估家装材料中典型挥发性有机物(VOCs)混合物体外条件下对永生化支气管上皮细胞(BEAS-2B)所致的急性毒性。方法选取装修材料中常见的12种挥发性有机物及其混合物作为研究对象,以液体染毒方式处理细胞,检测染毒后细胞的LC50、克隆存活、活性氧(ROS)产生和胞外乳酸脱氢酶(LDH)的变化,确定VOCs混合物的急性毒性。结果各VOCs作用于细胞后,其LC50值由0.70 g/L到22.80 g/L不等,而VOCs混合物细胞的LC50和克隆存活的LC50分别为0.82 g/L和0.30 g/L,毒性明显升高,展示出独特的化学性质和毒性特质,表明VOCs混合物的毒性效应是12种成分毒性效应的联合作用(协同、加强、超相加)的结果。同时VOCs混合物还诱导BEAS-2B细胞产生大量活性氧.OH和O2.-,使胞外LDH升高,且各效应与毒物作用剂量成正相关关系。结论VOCs混合物细胞毒性明显升高,表现为各成分的联合作用。它可诱导BEAS-2B细胞产生活性氧(ROS),引起细胞膜受损而死亡。且VOC混合物的急性毒性效应在高剂量时呈现细胞致死效应,较低剂量时呈现一种细胞转化效应。

永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

人乳头状瘤病毒16型E6E7肿瘤性转化人永生化支气管上皮细胞

目的 探讨人乳头状瘤病毒 (HPV) 16型E6E7片段对人永生化支气管上皮细胞系TR细胞的作用。方法 将E6E7片段构建入逆转录病毒载体 ,导入TR细胞 ,观察生长特性和致瘤性的改变 ;并用免疫沉淀 (IP) Westernblot检测p2 7蛋白功能及FAK、桩蛋白数量及磷酸化状况。结果 嘌呤霉素抗药性克隆TR/E6E7有E6E7的存在和稳定表达 ;TR/E6E7细胞系细胞生长加快 ,软琼脂集落形成能力增强 ,并具有裸鼠致瘤性 ;TR/E6E7细胞中与cyclinE/CDK结合的p2 7数量减少 ,即cyclinE/CDK活性增强。结论 转染E6E7的TR细胞可在裸鼠体内产生肿瘤 ,说明HPV感染在肺癌的发生中起一定作用。E6E7加快细胞增殖可能与它减少p2

蛋白质组学技术识别Maspin在支气管上皮永生化细胞和恶性转化细胞中的差异表达

背景与目的:Maspin蛋白是一种抑制肿瘤的丝氨酸蛋白酶抑制剂,它在抑制肿瘤生长和转移中发挥一定作用。本研究是利用蛋白质学技术鉴定Maspin在支气管上皮细胞恶性转化过程中的差异表达。方法:利用固相pH梯度等电聚焦双向电泳、肽质量指纹谱技术以及生物信息学技术,对Maspin在永生化细胞系及恶性转化细胞系的表达进行功能蛋白组学分析。结果:在分子量14.4～94kDa、等电点PI3～10范围内,2-D电泳分离出1500多个蛋白质点。凝胶图像分析显示Maspin蛋白在永生化细胞中的表达比恶性转化细胞表达高。Northernblot证实永生化细胞的MaspinmRNA丰度高于恶性转化细胞。结论:肺癌组织中Maspin在细胞转录和翻译水平的表达异常,这可能是肺癌发生的原因之一。

塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞的恶性转化(一)

目的 研究塞替派对人类支气管上皮细胞的致癌转化效应。方法 利用永生化人支气管上皮细胞(BEAS 2B)为靶细胞模型 ,以塞替派诱导BEAS 2B细胞的恶性转化 ,并伴随研究了塞替派转化细胞 (EBAS TE)的增殖动力学、细胞周期和锚着独立生长能力等转化表型特征。结果 经传代和软琼脂培养基筛选 ,BEAS TE具有较为稳定的转化表型和细胞生物学特性。结论 塞替派对人支气管上皮细胞具有较强的恶性转化效应。

云锡矿粉诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化

背景与目的研究云锡矿粉对人支气管上皮细胞的致癌转化效应,以探讨云锡矿工肺癌病因及其机制。材料与方法采用永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞,设200μg/ml及50μg/ml剂量的2个氧化矿染毒组和1个溶剂对照组,细胞染毒72h后,隔代染毒直至第9代。系统观察转化过程中细胞的生物学特性及血清抗性、锚着独立性生长能力等转化表型特征。结果第20代时各组细胞均未表现出血清抗性,第25代200μg/ml组细胞出现血清抗性和倍增时间增长、染色体畸变率增高;第30代时200μg/ml组细胞在软琼脂上可形成小的细胞集落,至第40代时,200μg/ml及50μg/ml剂量组细胞均能在软琼脂上形成克隆。结论云锡矿粉能体外诱发人支气管上皮细胞恶性转化。

信号传导及转录激活子3通路参与卷烟烟气凝集物诱导永生化人支气管上皮细胞的恶性转化

目的检测肺鳞癌组织、鳞状细胞不典型增生组织和癌旁组织中磷酸化信号传导及转录激活子3(p STAT3)蛋白的表达,比较其表达与吸烟的关系;探讨STAT3通路在烟草诱导细胞恶性转化过程中的作用。方法免疫组化法检测288例肺鳞癌组织、108例鳞状细胞不典型增生组织、112例癌旁组织中p STAT3蛋白的表达,比较其表达与吸烟的相关性。构建卷烟烟气凝集物(CSC)诱导第10,20,30,40,50,60及70代细胞(P10,P20,P30,P40,P50,P60及P70)永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化模型。从血清抗性及锚着独立性等方面对CSC诱导各代BEP2D细胞的恶性转化特征进行鉴定。Western蛋白印迹法检测CSC诱导各代BEP2D细胞中p STAT3的表达。MTT法和流式细胞术分别检测JSI-124 0.25~10μmol·L^(-1)对P70细胞存活及凋亡的影响。JSI-124处理CSC诱导P70 24 h后检测存活蛋白表达的变化。结果 p STAT3蛋白在肺鳞癌组织中表达高于鳞状细胞不典型增生和癌旁组织(P<0.05);p STAT3在目前吸烟者中的表达均高于曾经吸烟者和从不吸烟者(P<0.05),且随着吸烟指数增加两者表达水平逐渐升高(P<0.01)。随着转化代数的增高,细胞血清抗性增加,锚着独立性增强,P30细胞以后尤为明显。p STAT3在正常对照组和乙醇对照组中弱表达,且两者之间无显著性差异;CSC诱导的各组BEP2D细胞中,p STAT3的表达均显著高于正常对照组和乙醇对照组(P<0.05),并随细胞代数的增高而增高。JSI-124抑制P70细胞增殖、促进P70细胞凋亡呈浓度及时间依赖性。JSI-124 1μmol·L^(-1)作用P70细胞24 h后,存活蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 STAT3信号通过调控存活蛋白表达抑制细胞凋亡,参与烟草诱导永生化人支气管上皮细胞的恶性转化。

烟草悬凝物诱导永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中survivin基因及蛋白表达的研究

目的:探讨人支气管上皮细胞(BEP-2D)恶性转化过程中survivin基因及蛋白表达的变化。方法:选取正常BEP-2D细胞及经烟草悬凝物处理后的第15代(P-15)、25代(P-25)、38代(P-38)BEP-2D细胞共4组细胞株作为研究对象,采用半定量反转录PCR(Retro-translation PCR,RT-PCR)检测各组细胞株中survivin基因变化,免疫组织化检测各组中survivin蛋白的表达。结果:1.survivin mRNA在正常细胞BEP-2D中的表达强度为0.08,在转化的肺癌细胞P-15、P-25和P-38中分别为0.56、0.80和0.81。2.survivin蛋白在正常BEP-2D细胞株中表达阴性,在转化的3组细胞中表达阳性,且survivin蛋白在正常细胞与转化细胞株中的表达存在明显差异,其中在P-15具有明显差异(P<0.05)。结论:survivin基因及蛋白的表达水平可作为早期肺癌的一个检测指标。

鬼臼毒素纳米脂质载体的制备及体外对HPV感染的永生化人宫颈上皮细胞的作用

目的研究鬼臼毒素纳米脂质载体（POD-NLC）的体外对HPV感染的永生化人宫颈上皮细胞的作用。方法采用乳化蒸发法制备POD-NLC,分别应用扫描电镜、粒径仪、高效液相法等方法研究其表征,并观察其稳定性。分别以不同浓度（0.00011μg/ml）的POD-NLC和鬼臼毒素（POD）处理H8细胞,采用MTT法检测细胞的增殖活性,以荧光显微镜观察细胞的形态变化,流式细胞术（FCM）检测其凋亡率和细胞周期。结果①制备的POD-NLC扫描电镜下呈球形,有较好的稳定性,粒径为（85.6±10.25）nm,电位为（26.2±4.1）mV,包封率为（88.56±3.1）%;②POD-NLC能较强地抑制H8细胞的增殖,其抑制作用呈现时间和剂量依赖性;POD-NLC和POD作用72h对H8细胞的抑制率最高分别为95.8%、65.6%,半数抑制浓度（IC50）分别为0.015、0.13μg/ml;空白NLC对H8细胞的增殖无影响;③浓度为0.01μg/ml的POD-NLC和POD分别处理H8细胞48h后,H8细胞的凋亡率分别为（88.30±4.28）%和（59.95±3.26）%;荧光显微镜观察,均出现了核固缩、染色质高度凝聚、凋亡小体等典型的凋亡形态改变;与空白对照组相比,POD-NLC组和POD组G2/M期细胞比例明显增多,S期细胞比例无明显变化,G0/G1期细胞比例明显减少,但两组间细胞周期时相比例的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论该制备工艺可行;与POD相比,POD-NLC对H8细胞具有更强的增殖抑制和凋亡诱导效果,可使细胞阻滞于G2/M期。

人乳头状瘤病毒诱导食管上皮永生化细胞的双相分化

研究中期永生化食管上皮细胞的表型、细胞遗传学和部份基因的改变 ,以阐明癌前病变的特征。SHEE是该院用人乳头状瘤病毒HPV18E6E7诱导的永生化上皮 ,传至 6 1代已开始有少量细胞恶性转化。对永生化中期 31代培养细胞用相差显微镜检查细胞形态改变和细胞生长状态 (细胞接触抑制和锚定生长 ) ;流式细胞仪检测细胞周期 ;做染色体众数分析 ;多重PCR检查c-myc、p5 3、bcl- 2和ras等基因。免疫组化检查细胞角蛋白和鬼臼毒素荧光标记检查肌动蛋白F(F -actin)。软琼脂培养的集落细胞接种SCID小鼠检查成瘤性。Westernblot方法检测细胞内HPVE6表达蛋白。结果 :培养细胞有两种不同分化形态 ,分化差的基底细胞和分化好的鳞状上皮 ;前者角蛋白和F -actin极少 ,后者含量丰富 ;细胞接触抑制和锚锭生长特性减弱。分析 10 0个细胞染色体众数分二干系 ,5 6条 (占 30 % )和 6 1条 (占 2 4% )染色体 ,核型分析属于超二倍体 ,亚三倍体。多重PCR检查 :c -myc、p5 3基因上调 ,bcl- 2和ras基因阳性。用优选生长在软琼脂上的克隆细胞接种SCID小鼠 ,未成瘤 ;HPV18E6表达蛋白阳性。以HPV18E6E7诱导的食管永生化上皮 31代细胞形态出现了双向分化 ,根据其形态表型 ,双染色体众数的细胞遗传学改变和某些癌基因上调等特性 。

人支气管上皮细胞恶性转化过程中染色体畸变的研究

目的:研究在烟草特异性亚硝胺(NNK)诱发人支气管上皮细胞(BEAS-2B)恶性转化过程中染色体畸变,探讨其在吸烟高危人群罹患肺癌预警及普查方面的意义。方法用NNK诱发BEAS-2B细胞(BEAS-2BNNK)恶性转化,并在此过程中用常规中期染色体分析方法,动态观察染色体畸变的情况。结果:1．NNK诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型的建立①BEAS -2BNNK(实验组)第5代细胞血清抗性显著增强。②第15代BEAS-2BNNK细胞具有锚着独立性生长特性。③第20代BEAS -2BNNK细胞超微结构出现明显异型性。④第25代BEAS-2BNNK细胞在裸鼠体内成瘤,病理为高分化鳞形细胞癌。2．染色体畸变①BEAS-2B(对照组)二倍体细胞占细胞总数的91％-97％,传代后核型稳定;从第5代开始BEAS-2BNNK细胞即逐渐失去正常核型,随着传代次数增加,二倍体细胞比例从83％递减至54％,异倍体及多倍体细胞呈递增趋势,较对照组明显增高。②各代BEAS-2B细胞结构畸变发生率为2％-4％;除第5代BEAS-2BNNK细胞结构畸变总频率(11％)明显高于BEAS -2B细胞外,其余各代细胞与BEAS-2B细胞相近。结论:NNK能成功诱发人支气管上皮细胞(BEAS-2B)细胞恶性转化, 为进一步探讨肺癌发生机制、尤其是吸烟致肺癌发生机制提供了理想模型。染色体的异倍性和多倍性在NNK诱发BEAS- 2B细胞转化成肺癌过程中可能属早期事件,有望成为吸烟高危人群罹患肺癌的预警及普查指标之一。

EB病毒介导人鼻咽上皮细胞永生化早期阶段的生物学观察

EB病毒转化人鼻咽上皮细胞,建立体外多阶段细胞模型有利于从细胞和分子水平对肿瘤发病机制作深入研究。我们利用与鼻咽癌密切相关的EB病毒和TPA的协同作用,观察原代人胚鼻咽上皮细胞逃避老化期后其生物学特性的变化。结果表明,EB病毒感染的人胚鼻咽上皮细胞在原代培养后期老化相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)表达降低,形态学上发生改变,出现转化灶样集落,群体倍增时间降低,体外培养寿命延长,表明EB病毒促使部分原代人胚鼻咽上皮细胞逃避老化期、进入永生化早期阶段。这些研究资料为进一步阐明上皮细胞永生化分子机制及建立人鼻咽上皮细胞永生化模型提供实验依据。

EZH2蛋白在食管上皮永生化细胞系和恶性转化细胞系中的表达

目的研究EZH2蛋白在食管上皮永生化细胞系(SHEE)和恶性转化细胞系(SHEEC)中的表达。方法采用免疫细胞化学染色、免疫印迹分析和流式细胞术检测两种细胞系EZH2蛋白的表达。结果两种细胞EZH2蛋白染色均呈阳性,阳性反应定位于细胞核,部分细胞胞浆也有阳性着色。免疫印迹分析表明SHEEC细胞和SHEE细胞的总蛋白、核蛋白在分子质量约90ku的位置均出现特异性印迹条带。SHEE细胞中EZH2蛋白的表达强于SHEEC细胞(P<0.05)。流式细胞术显示EZH2蛋白在两种细胞中均有表达,两者的平均荧光强度无明显差别;阳性细胞率均较高,其中SHEE细胞阳性率高于SHEEC细胞。结论EZH2蛋白在SHEE细胞和SHEEC细胞中高表达可能参与了它们的恶性改变;而EZH2蛋白在两种细胞系中的差异表达可能与细胞的分化程度及来源于胚胎食管上皮细胞相关。

人支气管上皮细胞恶性转化过程中FHIT蛋白表达的研究

背景与目的目前大多数研究者分别研究了正常支气管上皮、癌前病变及肺癌组织(吸烟或不吸烟者)标本FHIT蛋白表达,而没有在肺癌发生发展过程中研究其表达及意义。本研究的目的是在烟草特异性亚硝胺(NNK)诱发人支气管上皮细胞(BEAS2B)恶性转化过程中,探讨FHIT蛋白表达的变化及其意义。方法用500mg/LNNK诱发BEAS2B细胞(对照组)恶性转化为BEAS2BNNK细胞(实验组),并在此过程中用免疫细胞化学方法动态观察FHIT蛋白表达的情况。结果㈠NNK诱发BEAS2B细胞恶性转化模型的建立:①第5代BEAS2BNNK细胞血清抗性显著增强;②第15代BEAS2BNNK细胞具有锚着独立性生长特性(软琼脂克隆形成);③第20代BEAS2BNNK细胞超微结构出现明显异型性;④第25代BEAS2BNNK细胞在裸鼠体内成瘤,病理类型为高分化鳞癌。㈡FHIT蛋白表达:BEAS2B细胞FHIT蛋白表达稳定,在各代之间的差异无统计学意义(P>0.05);第5代BEAS2BNNK细胞FHIT蛋白表达即有所降低,并随传代次数增加而进行性下降,但第25代细胞FHIT蛋白却呈高表达。结论①500mg/LNNK能成功诱发BEAS2B细胞恶性转化,为进一步探讨肺癌尤其是吸烟致肺癌的发生机制提供了理想模型。②FHIT蛋白表达减弱在肺癌发生过程中可能属早期事件,但FHIT蛋白在细胞恶性转化晚期上调表达值得进一步研究。

hTERT诱导永生化口腔黏膜上皮细胞株的建立

目的:转染外源性人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因建立永生化口腔黏膜上皮(oral mucosal epithelial,OME)细胞株。方法:利用反转录病毒载体将外源性hTERT基因转入OME细胞,G418筛选出抗性细胞克隆后,进行免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)鉴定细胞来源、细胞形态学观察、细胞增殖动力学研究、裸鼠成瘤实验以及hTERT基因和蛋白表达的检测。采用SPSS11.0软件包对数据进行统计学处理。结果:转染细胞与未转染细胞形态非常相似,均呈多边形、多角形,"铺路石"样排列;广谱角蛋白染色阳性,波丝蛋白染色阴性;未转染细胞体外培养36 d后停止生长,群体倍增数(population doublings,PDL)为9,转染细胞增殖活跃,PDL值超过80;RT-PCR和Western印迹结果均显示,hTERT在转染细胞中稳定表达,而在未转染细胞中不表达。结论:转染外源性hTERT基因的OME细胞呈稳定增殖的永生化状态。

基于永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02对猪源益生性乳酸菌的筛选

【目的】从健康仔猪的粪便及各肠段内容物和黏液中分离乳酸菌,并以永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02为体外细胞模型对猪源益生性乳酸菌进行筛选。【方法】采用分离培养和常规生化试验对乳酸菌进行分离与鉴定。用永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02作为体外模型,通过黏附性试验、耐酸耐胆盐试验和对致病菌的黏附抑制试验对菌株进行筛选。【结果】分离筛选出了12株乳酸菌,其黏附能力存在差异。Y091231、Y091221、Y224031、X302032、Y223052和Y223072等6株菌的黏附性较好,黏附指数依次为:2 903.25±83.33,2 320.37±81.02,1 965.43±37.72,1 416.12±62.74,1 100.00±68.10,988.73±17.06。对其进行耐酸耐胆盐试验和抑菌试验,结果表明,菌株Y091231、Y091221和Y224031对致病菌均具有较强的黏附抑制能力,且对高胆盐、低pH具有较强的耐受性。其中Y091231对大肠杆菌C83921的黏附抑制率可达(99.40±3.17)%,Y091221对致病性沙门氏菌的黏附抑制率为(97.10±2.04)%,Y091231对金黄色葡萄球菌CVCC2258的黏附抑制率为(98.00±2.31)%。Y091231、Y091221和Y224031 3株菌分别被鉴定为发酵乳杆菌、乳酸乳杆菌和嗜酸乳杆菌。【结论】筛选得到的3株益生性乳酸菌,不仅具有耐酸耐胆盐能力,而且对小肠黏膜上皮细胞具有强黏附性,对大肠杆菌C83921、致病性沙门氏菌和金黄色葡萄球菌CVCC2258具有较强的黏附抑制能力,可作为肠道微生态制剂的候选菌株。

食管上皮永生化细胞系研究进展

建立合适的模型系统是研究食管癌癌变过程的重要课题.食管永生化细胞株较难建立,他既具有正常细胞的特征,而且已经处于持续增生状态,易于转化,对研究食管癌变过程是一种良好工具模型.本文就近年来有关食管上皮永生化细胞的研究进展作一综述.

表达hTERT及SV40T永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立

构建pcDNA3.1-hTERT、pcDNA3.1-SV40 T载体,线性化后,共转染荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞,研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)和猿猴病毒40大T抗原(SV40 T)对荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞体外培养的作用,并对细胞进行RT-PCR检测分析及免疫荧光鉴定。结果表明,hTERT和SV40 T在奶牛乳腺上皮细胞中表达可以有效地延长细胞的体外培养时间,增加细胞传代次数,获得的细胞系可以正常表达角蛋白。说明在体外培养的乳腺细胞中共表达hTERT和SV40 T可以有效延长细胞寿命且不影响乳腺细胞特性。

塞替派诱发人支气管上皮细胞恶性转化过程中的基因突变(二)

目的 观察抗癌药物塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中相关基因的突变并分析其意义。方法 以塞替派作为致癌原诱导永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B) ,获得转化细胞 (BEAS TE)和克隆化多倍体癌前转化细胞 (BEAS STE)。采用PCR SSCP法检测上述 3种细胞p5 3、p16和Ki ras 3种基因是否出现点突变 ,进一步测序确定其突变情况。结果 SSCP结果阳性的有BEAS TE细胞p5 3第 7外显子 ,BEAS STE细胞p5 3第8外显子以及这二种细胞的p16基因第 1外显子 ;Ki ras基因第 1外显子的结果仅为可疑阳性。测序证明 ,p5 3、Ki ras基因存在多位点的碱基突变 ,而p16基因仅为单位点的碱基突变。结论 塞替派可诱发人支气管上皮细胞p5 3、Ki ras多位点的碱基突变和p16的单位点突变。分析前者为塞替派诱导细胞转化过程中发生的重要分子事件 。