构建永生化细胞的研究进展

人类细胞在正常增殖分裂过程中会到达衰老期(M1期)和致死期(M2期),细胞会停止分裂并凋亡,这种不可逆的生理过程是机体内在的一种抗肿瘤机制。然而细胞有限的增殖能力限制了细胞在基础实验、临床应用和生物工程等领域的研究。建立稳定、持续增殖且结构功能正常的永生化细胞系是当前细胞生物学研究的热点和难点。永生化细胞也是生产工程化血细胞的重要来源。本综述总结了永生化细胞的构建技术和可逆转性永生化细胞的研究进展。

树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株的建立及鉴定

目的建立树鼩视网膜来源的微血管内皮细胞的体外分离培养技术以及永生化细胞株,为体外利用树鼩视网膜微血管内皮细胞开展相关研究提供新的实验材料。方法利用Ⅱ型胶原酶、分散酶和DNaseⅠ酶消化法分离培养出原代视网膜微血管内皮细胞,利用差速消化法纯化内皮细胞,然后利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞,再挑取单克隆后进行传代培养。对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。结果采用混合酶消化法能够分离获得微血管内皮细胞,纯化后的细胞呈不规则多角形和梭形。经慢病毒转染后的细胞传代培养后细胞形态一致,到第50代时细胞形态结构仍较好。细胞免疫荧光结果显示标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1和永生化SV40T表达阳性。生长曲线结果显示:细胞生长旺盛,第2~4天时处于对数生长期,第4天进入平台期。细胞核型结果显示:染色体数与树鼩染色体相同,即所获取的细胞为永生化的树鼩视网膜微血管内皮细胞。结论成功建立的树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株具有较好的形态结构与功能,为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。

鸭脑微血管内皮细胞培养鉴定及其永生化细胞系的建立

本研究旨在获得高纯度鸭脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells,BMECs),并建立其永生化细胞系,为研究鸭疫里默氏杆菌的致病机制提供重要的试验材料。通过胰蛋白酶消化的方法成功分离出樱桃谷鸭原代BMECs,通过猿猴病毒40(Simian virus 40,SV40)转染的方法,转染后连续传12代获得樱桃谷鸭BMECs永生化细胞系。对BMECs的细胞核以及内皮细胞的标志性蛋白血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)进行免疫荧光染色观察,对原代细胞和永生化细胞系进行鉴定。结果显示,成功从樱桃谷鸭脑组织中分离出BMECs并传代培养,经慢病毒转染后体外传代培养12代以上,细胞仍稳定表达vWF,成功建立了樱桃谷鸭BMECs永生化细胞系。

蛋白质组学技术识别Maspin在支气管上皮永生化细胞和恶性转化细胞中的差异表达

背景与目的:Maspin蛋白是一种抑制肿瘤的丝氨酸蛋白酶抑制剂,它在抑制肿瘤生长和转移中发挥一定作用。本研究是利用蛋白质学技术鉴定Maspin在支气管上皮细胞恶性转化过程中的差异表达。方法:利用固相pH梯度等电聚焦双向电泳、肽质量指纹谱技术以及生物信息学技术,对Maspin在永生化细胞系及恶性转化细胞系的表达进行功能蛋白组学分析。结果:在分子量14.4～94kDa、等电点PI3～10范围内,2-D电泳分离出1500多个蛋白质点。凝胶图像分析显示Maspin蛋白在永生化细胞中的表达比恶性转化细胞表达高。Northernblot证实永生化细胞的MaspinmRNA丰度高于恶性转化细胞。结论:肺癌组织中Maspin在细胞转录和翻译水平的表达异常,这可能是肺癌发生的原因之一。

宫颈永生化细胞和癌细胞的胞质蛋白双向电泳图谱的建立及初步分析

目的:建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞(H8细胞株)和宫颈癌细胞(CaSKi细胞株)胞质蛋白双向电泳图谱,并初步分析找出特征性的差异蛋白点。方法:分别培养H8和CaSki细胞,用亚细胞结构蛋白质提取试剂盒提取胞质蛋白进行双向电泳,用ImageMaster 2D V2002.1图像分析软件分析电泳图谱,筛选差异蛋白点。结果:获得了分辨率和重复性均较好的宫颈永生化细胞和癌细胞胞质蛋白2-DE图谱,并分析找出了显著的差异蛋白点8个,其中3种蛋白质在宫颈癌细胞株表达上调,1种蛋白质表达明显下调,2种蛋白质在宫颈癌细胞株表达缺失,2种蛋白质在永生化细胞株表达缺失。结论:应用亚细胞蛋白双向凝胶电泳技术对HPV-16阳性的宫颈癌前和癌变的胞质蛋白分析,能有效找出蛋白质表达差异点,为进一步确定宫颈癌前病变和癌细胞的关键性差异蛋白质的结构和功能奠定了基础。

舌癌淋巴道转移模型中分离并建立舌癌细胞永生化细胞系

目的:在建立舌癌Tca8113淋巴道转移裸鼠模型的基础上,建立永生化的舌癌细胞系,并进一步探讨舌癌转移淋巴结组织中同源癌细胞相关标记物的表达情况,为舌癌干细胞研究提供基本的研究模型。方法:采用癌细胞足垫注射法建立淋巴道转移模型,4周后取淋巴结进行原代细胞培养并分离、纯化舌癌细胞进行连续传代培养、进行永生化细胞系的生物学特性鉴定。结果:在淋巴道转移模型中,HE染色与EMA免疫组化染色发现淋巴结有散在或灶性鳞状上皮癌细胞转移。进而取转移模型裸鼠的淋巴结组织进行原代细胞培养,经分离和纯化以及连续传代而建立舌癌永生化细胞系,命名为Tca8113-Ml,目前传代100余代,时间近2年,生长稳定,倍增时间为22.51h,染色体众数58,保持人染色体形态,细胞形态与Tca8113细胞相似。Tca8113-Ml在裸鼠体内的成瘤率为100%,裸鼠腋窝皮下成瘤的组织切片显示为典型的鳞状上皮细胞癌。结论:在舌癌淋巴道转移模型中,可分离培养与建立永生化的舌癌细胞系。

EZH2蛋白在食管上皮永生化细胞系和恶性转化细胞系中的表达

目的研究EZH2蛋白在食管上皮永生化细胞系(SHEE)和恶性转化细胞系(SHEEC)中的表达。方法采用免疫细胞化学染色、免疫印迹分析和流式细胞术检测两种细胞系EZH2蛋白的表达。结果两种细胞EZH2蛋白染色均呈阳性,阳性反应定位于细胞核,部分细胞胞浆也有阳性着色。免疫印迹分析表明SHEEC细胞和SHEE细胞的总蛋白、核蛋白在分子质量约90ku的位置均出现特异性印迹条带。SHEE细胞中EZH2蛋白的表达强于SHEEC细胞(P<0.05)。流式细胞术显示EZH2蛋白在两种细胞中均有表达,两者的平均荧光强度无明显差别;阳性细胞率均较高,其中SHEE细胞阳性率高于SHEEC细胞。结论EZH2蛋白在SHEE细胞和SHEEC细胞中高表达可能参与了它们的恶性改变;而EZH2蛋白在两种细胞系中的差异表达可能与细胞的分化程度及来源于胚胎食管上皮细胞相关。

舌癌永生化细胞系细胞淋巴道转移裸鼠模型的建立

目的：建立人舌癌细胞Tca8113-M1裸鼠淋巴结转移模型，研究分析其转移的特性，为舌癌转移的研究提供动物模型。方法：4～6周龄裸鼠随机分为生理盐水对照组、Tca8113-M1组、Tca8113组，通过足垫注射舌癌细胞，建立淋巴道转移模型。观察各组裸鼠淋巴结转移情况，进行H-E染色、上皮膜抗原（EMA）免疫组织化学显色及淋巴结舌癌细胞纯化培养。结果：淋巴结有散在或灶性鳞状上皮细胞转移，体外纯化培养的癌细胞呈上皮样生长。Tca8113-M1组淋巴结转移率为88％，Tca8113组仅为60％。结论：足垫注射舌癌永生化细胞系Tca8113-M1细胞系细胞建立淋巴道转移模型具有简单、稳定、转移率高等特点，为舌癌淋巴道转移的机制研究提供了一个良好动物模型。

食管上皮永生化细胞系研究进展

建立合适的模型系统是研究食管癌癌变过程的重要课题.食管永生化细胞株较难建立,他既具有正常细胞的特征,而且已经处于持续增生状态,易于转化,对研究食管癌变过程是一种良好工具模型.本文就近年来有关食管上皮永生化细胞的研究进展作一综述.

雌二醇促进正常宫颈上皮永生化细胞系End1/E6E7增殖的研究

[目的 ]研究在 17- β -E2 作用下正常宫颈上皮永生化细胞End1/E6E7的生长增殖和HPV16 /E6E7基因、ERβ表达的变化 ,探讨雌激素及HPV与ERβ在宫颈上皮病变发展过程中的作用。[方法 ]选取ERα(- ) /ERβ(+ )的正常宫颈上皮永生化细胞系End1/E6E7细胞 ,应用MTT比色实验及流式细胞术研究 17- β -E2 对其生长与增殖的调控作用 ;应用RT -PCR方法半定量研究 17- β -E2 对该细胞中HPV16 /E6E7基因及ERβ基因表达的影响。 [结果 ]随 17- β -E2 浓度增加 ,倍增时间缩短 ,MTT吸光度值增高 (P =0 .0 4 5 ) ,细胞周期G0 、G1期比例下降 ,G2 、M及S期比例上升 (P =0 .0 0 2 ) ;HPV16 /E6E7mRNA表达增强 (P =0 .0 19) ;ERβmRNA表达无明显改变 (P =1.0 0 )。 [结论 ]雌激素可能通过ERβ以外的途径促进HPV16 /E6E7基因的表达 ,进而促进永生化宫颈上皮的增殖生长。

MLH1R217C/BRAFV600E突变型家族性甲状腺乳头状癌永生化细胞系的建立及鉴定

目的建立家族性甲状腺乳头状癌(FPTC)永生化细胞系,为研究家族性非髓样甲状腺癌(FNMTC)提供新的途径。方法选取FPTC患者的肿瘤标本,采用消化法分离原代细胞。使用改良的DMEM/F12培养基,添加促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、表皮细胞生长因子(EGF)及氢化可的松等进行培养。在原代细胞早期分2种方式导入外源基因SV40T/TERT用于诱导永生化。利用RT-PCR检测甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(TG)、促甲状腺激素受体(TSHR)、钠/碘共同转运体(NIS)等基因的表达,同时利用免疫荧光技术检测TPO及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)蛋白的表达。提取该患者外周血DNA,进行突变基因的检测。提取细胞基因组PCR扩增后测序,进行突变基因的检测。结果分离的FPTC原代细胞呈梭形或不规则多角形贴壁生长;细胞生长6个月,转染SV40T组(标记为FPTC-S)传代至p26,FPTC细胞传代至p23,转染SV40T+h TERT组(标记为FPTC-ST)传代至p19,细胞增殖能力较好;FPTC-S与FPTC-ST细胞均能够在基因水平稳定表达TPO、TG与TSHR;患者外周血中存在MLH1 R217C胚系突变;原代细胞存在BRAF V600E突变;原代细胞及永生化的细胞系中均存在MLH1 R217基因突变。结论本研究初步建立了FPTC永生化细胞系,且该细胞系中存在MLH1 R217C及BRAF V600E突变,该细胞系将为研究以上突变及其相互作用关系提供研究模型。

人乳头瘤病毒永生化细胞的研究进展

人乳头瘤病毒 (HPV)感染与人类各种良性或恶性病变密切相关。建立在永生化细胞株基础上的研究为阐明HPV在细胞生长调控和癌变机制方面的作用提供了有价值的线索。

脆性X综合征外周血淋巴细胞永生化细胞系的建立与验证

脆性 X 综合征(fragile X syndrome,FXS)是一种 X 连锁不完全外显性遗传病,是引起遗传性智力低下和孤独症谱系障碍最常见的单基因病[1],因细胞中 X 染色体末端在特殊培养基中经诱变剂作用后可显示如同断裂的脆性部位而得名。

汉族家族性高胆固醇血症患者永生化细胞株的构建及其LDL-R功能的研究

目的:构建汉族家族性高胆固醇血症(FH)患者永生化细胞株;分析细胞表面低密度脂蛋白受体LDL-R活性。方法:将研究对象20例分为3组:(1)FH纯合组6人,为临床确诊的家族性高胆固醇血症纯合患者;(2)FH杂合组12人,为纯合患者的父母;(3)正常对照组2人,为血脂正常者;采用EB病毒转化外周血淋巴细胞;免疫组化法观察细胞表面LDL-R分布;流式细胞技术观察淋巴细胞LDL-R功能,4℃时检测其对LDL结合能力,37℃时检测其对LDL内化功能。结果:免疫组织化学法,在光镜下可见淋巴细胞表面散在分布的LDL-R,呈现棕褐色颗粒样;流式细胞技术对3组细胞株检测证实LDL-R功能存在差异,EB病毒转化的细胞株具有永生化特性;正常组LDL-R平均表达量111.35,高于杂合组(97.17)及纯合组(60.62);纯合组37℃内化量228.61,4℃结合量95.20,结合量为正常人的41.6%,杂合组37℃内化量91.28,4℃结合量67.42,结合量为正常人的73.8%。结论:采用EB病毒转化外周血淋巴细胞,成功地构建了汉族家族性高胆固醇血症患者的永生化细胞株,此细胞株的功能研究表明其具有稳定的永生化特性,完整地保存了FH患者的细胞种质。

遗传眼病永生化细胞系建立方法

目的通过遗传眼病患者的外周血或皮肤组织建立永生化细胞系,以保存其遗传资源。方法永生化B淋巴细胞系的建立:抽取患者静脉血,分离淋巴细胞,以EB病毒体外转化B淋巴细胞为类淋巴母细胞,利用环孢霉素A抑制T淋巴细胞RNA聚合酶Ⅱ活性,防止已转化B淋巴细胞因受到T淋巴细胞的攻击而退化,培养后建立永生化B淋巴细胞系;皮肤成纤维细胞原代培养:利用DispaseⅡ酶处理离体皮肤组织以分离表皮组织,将其余组织剪碎后贴瓶培养,成纤维细胞可从组织块爬出,生长成为细胞系。结果永生化B淋巴细胞系:共完成标本17例,成功建系15例,成功率88.2%;经过转化后B淋巴细胞悬浮生长,胞浆丰富、形态各异,聚集成团,可无限传代用于实验研究。皮肤成纤维细胞原代培养:共完成标本5例,成功建系3例,成功率60.0%;皮肤成纤维细胞贴壁生长,呈典型纺锤形,中间饱满,两边细长,50代以内增殖旺盛可用于实验研究。结论通过遗传眼病患者的外周血和皮肤组织可建立永生化B淋巴细胞系和皮肤成纤维细胞系以保存其全部遗传信息,为进一步研究相关遗传性眼病奠定物质基础。

3种肝源永生化细胞药物代谢酶表达差异比较研究（英文）

目的比较3种人源肝永生化细胞LX-2,L02和HepG2药物代谢酶的表达差异,确定适合于特定细胞色素P450(CYP)亚型研究的细胞类型。方法体外培养人源传代肝细胞L02,LX-2和HepG2,以奥美拉唑(Ome)、地塞米松(Dex)、苯巴比妥钠(Phe)、异烟肼(Iso)和利福平(Rif)0,5,10,20和40 μmol·L^-1进行诱导。CCK-8法检测细胞存活,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测LX-2细胞中CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1 和 CYP3A4 基因表达水平;Western印迹法检测LX-2,L02 和HepG2细胞中以上7种CYP亚型蛋白表达水平;LX-2,L02和HepG2经Rif 5,10,20和40 μmol·L^-1诱导后,Luciferin-PFBE法检测细胞中CYP3A4酶活性变化。结果 CCK-8结果显示,与相应细胞对照组相比,Ome,Dex,Phe,Iso和Rif (≤ 40 μmol·L^-1)作用于LX-2,L02和HepG2细胞24 h,细胞存活率均>80%;RT-qPCR法检测结果显示,与LX-2细胞对照组相比,Phe诱导CYP2B6(P<0.05)和CYP2D6(P<0.01)表达上升;Western蛋白印迹结果显示,L02,LX-2和HepG2细胞经Ome,Dex,Phe,Iso和Rif 40 μmol·L^-1处理后,CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和CYP3A4蛋白表达存在差异。L02细胞中 CYP2C9(IA=1.58±0.07),CYP2C19(IA=0.96±0.02)和 CYP3A4(IA=1.30±0.01),LX-2 细胞中CYP2B6(IA=1.48±0.01)和 CYP2D6(IA=1.46±0.02),HepG2 细胞中的CYP1A2(IA=1.62±0.19)和CYP2E1(IA=1.49±0.10)分别具有最高的表达丰度。CYP3A4 酶活性检测显示,Rif 处理 L02,LX-2 和HepG2细胞24 h后,CYP3A4活性变化无统计学差异。结论 L02,LX-2和HepG2细胞中CYP亚型蛋白表达丰度差异提示,L02 细胞适用于 CYP2C9,CYP2C19 和 CYP3A4 实验;LX-2 细胞适用于 CYP2B6 和CYP2D6实验;HepG2细胞适用于CYP1A2和CYP2E1实验。

遗传性牙龈纤维瘤病家系永生化细胞库的建立及染色体初步分析

目的:建立遗传性牙龈纤维瘤病(HGF)家系外周血永生化淋巴细胞系,以永久保存现有患病家系特有的基因组资源,并探讨将其作为HGF发病机理研究的生物材料的可行性和可靠性。方法:在知情同意原则下,收集5个常染色体显性遗传HGF家系外周血样品,采用新鲜血法和冻存白细胞法,通过EB病毒(EBV)联合环孢霉素A(CyA)转化处理获得外周血永生化淋巴母细胞系,制备并分析细胞系的中期染色体片,检测建系前后的遗传稳定性。结果:成功建立5个HGF家系的永生化B淋巴母细胞系,所有建成细胞系冻存后复苏成功率达100%,转化前后的淋巴母细胞系G带显色核型分析无明显差异。结论:EB病毒转化构建的永生化淋巴细胞系遗传学特性稳定,可永久保存HGF家系资源,为今后在细胞和分子水平上开展HGF发病机理、诊断和治疗提供随时可取的实验材料奠定了基础。

白芨外泌体的分离及对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的凋亡保护研究

探索鲜白芨(Bletilla striata)外泌体对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的生物活性,为其在护肤品上的开发提供数据。聚乙二醇(PEG)沉淀法提取白芨外泌体,透射电镜鉴定,BCA法测蛋白浓度;细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8,CCK8)法检测Hacat细胞存活率,流式双染检测凋亡,蛋白印迹法检测凋亡相关通路蛋白。白芨外泌体呈茶杯状具双层膜,平均粒径69.63 nm,每克鲜白芨含外泌体浓度为5.24E+8 Particles,内含蛋白19.53μg;白芨外泌体(≥5μg/mL)可显著提高体外Hacat细胞存活率(P<0.05);10μg/mL白芨外泌体处理48h,可显著降低H_(2)O_(2)氧化造模引起的Hacat细胞早凋亡、晚凋亡和总凋亡的细胞比例(P<0.01),同时,模型组caspase-9和caspase-3表达显著上升,外泌体处理能显著降低其表达,而Bcl-2表达在组间无差异(P<0.05)。PEG沉淀法分离的白芨外泌体,可促进体外Hacat生长,抑制H_(2)O_(2)引起的细胞凋亡且与蛋白caspase-9和caspase-3相关。

动物细胞永生化研究进展

细胞永生化是指通过各种手段、方式来突破原代细胞衰老的限制,延长细胞寿命,实现细胞无限复制增殖,是当前生物医学领域研究的一个热点与难点。永生化细胞株/系可用于生物制品研发、衰老机制探索以延伸生命等;然而目前永生化细胞种类不多、永生化技术相对较难,肿瘤风险以及动物福利伦理等原因,还不能满足研发需求。目的细胞永生化不仅可以永久保存动物细胞遗传资源,还对多种疾病的诊断、治疗及细胞基质疫苗的研发等提供支持。本文就动物细胞永生化的原理、永生化机制及方法的研究最新进展进行综述,为未来的生物医学研究和应用提供参考。