倒千里光碱处理SD大鼠永生化肝细胞同种脾内移植增殖实验研究

目的探讨倒千里光碱(Retrorsine, Rts)处理对SD大鼠永生化肝细胞同种脾内移植增殖效率的影响。方法SV40 T抗原转染法制备永生化肝细胞。成熟SD大鼠24只,随机分为A、B、C 3组,A组为Rts处理SD大鼠永生化肝细胞移植组;B组为Rts处理SD大鼠正常肝细胞移植组;C组为正常SD大鼠永生化肝细胞移植组。A、B两组SD大鼠分2次腹腔注射Rts,间隔2周,第2次注射Rts 4周后备用。20%肝叶切除后,3组SD大鼠分别行永生化肝细胞移植或肝细胞移植,常规病理切片检查脾内移植永生化肝细胞增殖效率,免疫组化检测脾脏内移植永生化肝细胞白蛋白表达,透射电镜检测移植永生化肝细胞形态。结果病理检查显示,肝细胞移植后3周内,3组SD大鼠脾脏内均可见移植肝细胞;免疫组化结果显示,3组SD大鼠脾脏实质内均可见散在棕黄色白蛋白颗粒,A组大鼠脾脏内肝细胞面数密度与B组比较无显著差异,但与C组有显著差异;透射电镜检测结果显示,脾内移植永生化肝细胞具有正常肝细胞的超微结构。结论脾内移植永生化肝细胞具有正常肝细胞的形态、结构及白蛋白表达功能;Rts可促进永生化肝细胞SD大鼠脾脏内移植的增殖效率。

BALB/c裸鼠脾内移植人源性永生化肝细胞HepLL的生物学特性

目的研究人源性肝细胞HepLL经脾内途径移植后在体内的生物学特性。方法将人源性肝细胞HepLL移植入切除肝左叶和未切除肝左叶的BALB/c裸鼠脾内,通过病理和免疫组化方法检测其生物学特性。结果新建的人源性肝细胞移植入BALB/c裸鼠脾脏后可长期成团存活、增殖并表达肝细胞特异性标记物HEP,且有糖原的堆积,同时始终未检测到甲胎蛋白的表达。至移植后第30天,脾脏内移植的HepLL细胞切除左肝组比未切左肝组增生活跃。移植入脾脏的人源性肝细胞可向宿主肝脏移行并进入肝实质,同时可长期在宿主肝脏内增殖。结论移植入脾脏的人源性肝细胞HepLL可保持其原有的生物学特性,并能移行、整合入肝脏;肝左叶切除造成的肝细胞再生微环境有利于移植的人源性肝细胞HepLL的增殖。

C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景:获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。目的:比较用UW液在4℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。方法:贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4℃低温保存0,24,48及72h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。结果与结论:随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞(P<0.01);细胞凋亡率呈上升趋势,但48h后C3A细胞同L-02细胞无差异(P>0.05)。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞(P<0.01)。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞(P<0.01)。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞(P<0.01)。结果提示,UW液4℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。

永生化肝细胞移植(文献综述)

肝细胞移植治疗肝脏疾病已有 2 0多年的历史 ,但移植肝细胞增殖困难一直困绕着该项研究的进展。永生化肝细胞增殖能力强大 ,某些肝细胞前体细胞具备分化潜能 ,用于移植有助于此类问题的解决 ,本文就近年来的有关研究综述如下。

永生化肝细胞系研究进展

衰老是体外培养的哺乳动物细胞的一般特性。从动物或人的组织细胞取材培养，体外经过第一次传代后的具有增殖能力的细胞群体称为细胞系。一些细胞系在体外有一定寿命，只能有限期传代，一般不超过50代，称为有限细胞系；另一类体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力、可以无限传代的细胞系称为永生化细胞系。

可回复性肝细胞永生化载体pCTGTKlox的构建、鉴定、转染与表达

目的构建可回复性永生化逆转录病毒载体,为肝细胞可回复性永生化奠定基础。方法扩增加强型绿色荧光蛋白(EGFP)及胸腺激酶(TK)并采用重叠延伸拼接法(SOE)连接EGFP和TK,将EGFP-TK融合基因亚克隆至pBABE-puro-lox,构建成新载体pBGTKlox,再将永生化基因SV40T连接至pBGTKlox,构成新载体pBTGTKlox,最后将雌激素受体与重组酶融合基因(Cre-ER)连接至pBTGTKlox,构成新载体pCTGTKlox。将pCTGTKlox和pPDF15质粒共转染包装细胞PT67,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。免疫组化染色检测SV40T基因的表达。结果成功构建包含EGFP-TK、SV40T、Cre-ER及重组序列loxP的新载体pCTGTKlox,经酶切鉴定证实为重组阳性体,经测序验证无核苷酸突变。pCTGTKlox转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光。免疫组化染色显示细胞胞核呈阳性染色。结论成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体pCTGTKlox,为细胞的可回复性永生化提供了一种良好的新型载体。

永生化肝细胞微囊化移植治疗大鼠肝豆状核变性

目的观察微囊化HepG2细胞腹腔移植治疗肝豆状核变性(HLD)模型大鼠的疗效。方法 3月龄Wistar雄性大鼠120只随机分为HLD模型组、裸HepG2细胞腹腔移植组和微囊化HepG2细胞移植组,采用铜负荷饮食法制作大鼠HLD模型。根据移植后标本采集时间分设3d、7d、14d、21d、28d5个时间点,每时间点8只大鼠;另取8只大鼠设为空白对照组。测定血清ALT、AST、白蛋白水平及血清铜、肝铜含量。结果模型组、裸HepG2细胞腹腔移植组、微囊化HepG2细胞移植组大鼠各时间点ALT、AST、血清铜、肝铜水平均较空白对照组升高(P<0.05),合成白蛋白水平明显下降(除外微囊化HepG2细胞移植组28d与空白组比较差异无统计学意义)。在大部分时间点裸HepG2细胞腹腔移植组、微囊化HepG2细胞移植组大鼠ALT、AST、血清铜、肝铜值水平较模型组下降(P<0.05),而白蛋白水平则较模型组增加(P<0.05)。7～14d后微囊化HepG2细胞移植组大鼠ALT、AST、血清铜、肝铜水平较裸HepG2细胞腹腔移植组明显下降(P<0.05),而白蛋白则于14d后高于裸HepG2细胞腹腔移植组。结论 HepG2细胞微囊化腹腔移植可明显减轻HLD大鼠的肝损害,减少肝铜沉积,加速血清铜的代谢,可成为一种细胞移植治疗HLD的新方法。

无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建和结构鉴定

目的构建不携带病毒基因且可回复的肝细胞永生化载体,优化目前的肝细胞永生化方法。方法构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的无病毒可回复性肝细胞永生化载体,PCR扩增attB1-Kozak-hTERT(前端)-attB2和attB1-hTERT(后端)/E2A/eGFP/F2A/neo-attB2,对相应大小条带切胶回收后,通过Gateway重组克隆技术BR反应和LR反应,以及酶切连接,构建最终目的载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo。结果 PCR及酶切和测序鉴定均证实成功构建了肝细胞永生化载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo,目的基因序列与GenBank报道一致。结论成功构建不携带病毒基因且可实现回复的肝细胞永生化载体,有望提高永生化肝细胞临床应用的安全性。

3种肝源永生化细胞药物代谢酶表达差异比较研究（英文）

目的比较3种人源肝永生化细胞LX-2,L02和HepG2药物代谢酶的表达差异,确定适合于特定细胞色素P450(CYP)亚型研究的细胞类型。方法体外培养人源传代肝细胞L02,LX-2和HepG2,以奥美拉唑(Ome)、地塞米松(Dex)、苯巴比妥钠(Phe)、异烟肼(Iso)和利福平(Rif)0,5,10,20和40 μmol·L^-1进行诱导。CCK-8法检测细胞存活,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测LX-2细胞中CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1 和 CYP3A4 基因表达水平;Western印迹法检测LX-2,L02 和HepG2细胞中以上7种CYP亚型蛋白表达水平;LX-2,L02和HepG2经Rif 5,10,20和40 μmol·L^-1诱导后,Luciferin-PFBE法检测细胞中CYP3A4酶活性变化。结果 CCK-8结果显示,与相应细胞对照组相比,Ome,Dex,Phe,Iso和Rif (≤ 40 μmol·L^-1)作用于LX-2,L02和HepG2细胞24 h,细胞存活率均>80%;RT-qPCR法检测结果显示,与LX-2细胞对照组相比,Phe诱导CYP2B6(P<0.05)和CYP2D6(P<0.01)表达上升;Western蛋白印迹结果显示,L02,LX-2和HepG2细胞经Ome,Dex,Phe,Iso和Rif 40 μmol·L^-1处理后,CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和CYP3A4蛋白表达存在差异。L02细胞中 CYP2C9(IA=1.58±0.07),CYP2C19(IA=0.96±0.02)和 CYP3A4(IA=1.30±0.01),LX-2 细胞中CYP2B6(IA=1.48±0.01)和 CYP2D6(IA=1.46±0.02),HepG2 细胞中的CYP1A2(IA=1.62±0.19)和CYP2E1(IA=1.49±0.10)分别具有最高的表达丰度。CYP3A4 酶活性检测显示,Rif 处理 L02,LX-2 和HepG2细胞24 h后,CYP3A4活性变化无统计学差异。结论 L02,LX-2和HepG2细胞中CYP亚型蛋白表达丰度差异提示,L02 细胞适用于 CYP2C9,CYP2C19 和 CYP3A4 实验;LX-2 细胞适用于 CYP2B6 和CYP2D6实验;HepG2细胞适用于CYP1A2和CYP2E1实验。

永生化人肝细胞HepZJ的临床前急性毒性评价

背景:肝细胞移植、肝脏组织工程与生物人工肝的研究为肝衰竭患者带来福音,然而截至目前仍未发现十分合适的种子细胞。课题组前期自行构建人永生化肝细胞系HepZJ作为新的种子细胞,并进行了临床前安全性评价研究。目的:对新型永生化人肝细胞系HepZJ进行急性毒性研究,为HepZJ应用于临床可能发生的毒副反应以及设计安全剂量提供参考依据。方法:在HepZJ细胞急性毒性研究中,将低、中、高(5×10~6,5×10~7,8.25×10~7)3个剂量组的HepZJ细胞悬液和空白对照溶液经尾静脉单次注射进入SD大鼠体内,观察大鼠的临床症状和体质量变化,注射结束后第1天以及第14天剖检进行血液学相关检验、大体病理和免疫组化检查,综合分析该细胞系的毒副反应和安全剂量。结果与结论:在HepZJ细胞急性毒性研究中,高剂量组大鼠注射结束时出现1只死亡,与对照组比较,血常规、凝血功能和血清生化部分指标差异有显著性意义(P <0.05);14 d后各项检查差异无显著性意义(P> 0.05)。低剂量组和中剂量组大鼠与对照组在临床症状、体质量变化、血液指标和大体病理形态上差异均无显著性意义。结果表明,永生化人肝细胞系HepZJ单次注射安全剂量为5×10~7/只,无明显毒副反应,剂量过大时可出现明显毒副反应,包括炎症应激、凝血障碍和肝功能损伤等,甚至死亡。因此,只有准确控制HepZJ的使用剂量,才能保证该细胞的临床应用安全性。

生物人工肝细胞材料的研究进展

近年来,许多学者对生物人工肝(bioartificial liver,BAL)多种来源的细胞材料进行了广泛深入地研究和探索,但生物人工肝细胞材料的来源问题至今仍未得到满意解决。本文对近年来生物人工肝细胞材料研究进展进行综述,以期为建立和选择理想的生物人工肝细胞材料的深入研究提供参考。

生物人工肝的细胞来源及其研究进展

肝衰竭的病死率极高,生物人工肝(BAL)是治疗肝衰竭的重要措施。目前,肝细胞作为BAL的主要生物成分,其来源一直是BAL系统研究的重点及难点之一,现就BAL系统应用的肝细胞来源作一综述。

生物人工肝用肝细胞源的研究进展

生物人工肝支持系统是目前公认的治疗因各种原因所致暴发型肝衰竭最有前途的方法,已在动物实验及临床应用中取得了确切疗效。肝细胞作为生物人工肝的主要生物成分,在该系统中扮演举足轻重的角色,本文就近年来作为生物人工肝用肝细胞的研究进展作了综述。

SV40LT抗原介导的人源性肝细胞系的构建

目的 :建立人源性永生化肝细胞系 ,为生物人工肝和肝细胞移植等提供合适的细胞源。方法 :利用 SV4 0 L Tag基因和真核表达载体 pc DNA3.1(- )经脂质体转染至来源于 2 5岁男性脑死亡者供肝的原代培养细胞 ,使其永生化 ,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能。结果 :经 G4 1870 0～ 30 0μg/ ml筛选 ,4 2天后获一抗 G4 18永生化肝细胞系。该细胞系呈单层贴壁、上皮细胞样形态生长 ,体外培养可无限传代 ,具有分泌 AL B、ALT、AST及 LDH的功能 ,超微结构观察发现 ,转染肝细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征 ,如较大的细胞核、胞浆内含有丰富的糖原颗粒、大量的线粒体和粗面内质网等。经 RT- PCR和 Western blot检测 ,转染肝细胞的 ALB m RNA阳性和细胞色素 P4 5 0 2 E1阳性。结论 :新建人源性肝细胞系与原代培养肝细胞具有类似的形态学特征和生物学功能。

生物人工肝的几种细胞来源

本文探讨了生物人工肝不同的种子细胞来源及其优缺点及其存在的问题和研究进展。

肝窦内皮细胞对肝细胞生物学特性影响的体外研究

目的:探讨永生化人肝窦内皮细胞(IHLESC)能否提高肝细胞的代谢、解毒及合成功能。方法:设立永生化人肝细胞(IHH)单独培养组和IHLESC与IHH共培养组,评价两种不同培养方式对肝细胞代谢、解毒和合成功能的影响;将两组细胞分别接种于微载体上,分别与肝衰竭患者血浆共孵育,比较两组IHH的解毒功能。结果:相比于单独培养组,共培养组IHH密切接触,聚集成团。共培养组IHH的谷氨酰胺合成酶(GS)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、鸟苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)、白蛋白(ALB)表达量均显著高于单独培养组(P<0.01)。共培养组血浆总胆红素的下降及血浆尿素的上升均比单独培养组显著(P<0.01)。结论:用IHH与IHLSEC在微载体上共培养制备成新型生物人工肝的核心材料,可提高生物人工肝细胞的代谢、解毒及合成功能。

黄曲霉毒素B1诱导的恶性转化肝细胞miRNA表达谱的变化

目的:检测黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)诱导的恶性转化肝L02细胞(L02T)的miRNA表达谱,寻找差异表达的miRNA。方法:以含有AFB1的培养液多次间歇性染毒L02细胞获得转化细胞L02T,通过miRNA芯片技术检测和分析对照L02和转化L02T细胞的miRNA表达谱;用实时荧光定量PCR方法对芯片结果加以验证;采用TargetScan软件预测miRNA可能调控的靶基因。结果:获得2组细胞856个miRNA的表达谱,在25个表达差异显著的miRNA中,15个表达上调,10个表达下调;用定量RT-PCR对芯片结果中表达差异的miR-320a、miR-638和miR-98进行验证,并对其中上调显著的miR-638进行生物信息学分析,预测到4个与肝癌相关的潜在靶基因。结论:在AFB1诱导的恶性转化肝L02细胞中筛查出25个表达差异显著的miRNA,差异表达的miRNA可能在细胞恶性转化过程中起重要作用。

代谢活化系统在人细胞转化模型中的应用

【目的】探讨不同的代谢活化系统在人细胞转化模型中潜在的应用价值。【方法】在永生化人肝细胞L02中导入第12密码子突变的H-RAS癌基因(L02-R细胞),使其处于恶性转化前的易感状态。选择具有代表性的间接致癌物黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)作用于永生化和转化前期细胞株,采用三种代谢系统:高表达代谢酶P450 CYP1A2,低剂量底物诱导和加入经典的大鼠S9代谢辅助系统,通过软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验来比较在不同的代谢活化系统下,间接致癌物诱导细胞转化的效能。【结果】蛋白印迹验证H-Ras稳定高表达的转基因细胞株构建成功。通过Ames试验,蛋白印记和CYP1A2酶活性等方法比较三种代谢系统酶活性。在未加代谢系统的条件下,经AFB1染毒后第17周L02-R细胞发生转化,而对照组细胞L02-V在染毒20周未能发生转化。而加入S9代谢系统时,AFB1诱导L02-R细胞在第8周发生转化,比未加代谢系统缩短了9周;经低剂量0.1μmol/LAFB1诱导和高表达CYP1A2均使L02-R的转化间期缩短6周,于第11周发生转化。【结论】三种代谢系统都能够促进间接致癌物AFB1的代谢活化,缩短细胞转化的时间,提高细胞转化效率。与传统的S9代谢活化系统相比,低剂量诱导作为新的代谢活化的方法在细胞转化试验中有着良好的应用前景。