乳痈方对4T1乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞表型变化的作用及机制研究

目的:探讨乳痈方对4T1乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞表型变化的作用及机制。方法:①选用BALB/c小鼠,建立4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型。模型动物随机分为模型组、环磷酰胺(CTX,30 mg/kg)组和乳痈方低、中、高剂量(0.145,0.29,0.58 g/kg)组,每组4只。各组给予相应干预,连续20 d。末次给药后,采集小鼠胸腺、肺、脾、肿瘤、淋巴结组织,计算脏器指数和抑瘤率;观察肺表面结节情况,计算肺转移率。HE染色后光镜下观察胸腺形态学变化,免疫组化检测胸腺组织钙黏附蛋白E(E-cadherin)和波形纤维蛋白(Vimentin)的表达。②体外分离小鼠原代胸腺上皮细胞(TECs),通过转染SV40T基因构建永生化TECs(iTECs)并验证。采用不同浓度(0、25、50、100、200、400μg/ml)乳痈方提取液处理iTECs。细胞培养48 h后,MTT法检测细胞增殖率,结晶紫染色观察细胞增殖情况。将iTECs分为空白组、TGF-β1组(10 ng/ml TGF-β1)、乳痈方低剂量组(10 ng/ml TGF-β1+50μg/ml提取液)、乳痈方中剂量组(10 ng/ml TGF-β1+100μg/ml提取液)、乳痈方高剂量组(10 ng/ml TGF-β1+200μg/ml提取液)。先加入TGF-β1诱导48 h后,再给予相应浓度的乳痈方提取液干预24 h。免疫荧光和PCR检测细胞表型标志物E-cadherin、Vimentin、α-微管蛋白(α-tubulin)及相关转录因子Zeb 1、Snail 1的表达水平。建立Smad转染的iTECs,荧光素酶报告基因检测乳痈方对TGF-β1诱导的转染iTECs细胞Smad通路活化的影响。结果:①与模型组相比,乳痈方低、中、高剂量组的肿瘤指数均显著降低(P<0.05),抑瘤率分别为33.45%、31.43%和6.49%;肺转移总数以及直径>2 mm转移灶数均明显减少(P<0.05,P<0.01),肺转移率分别为75%、75%和100%。HE染色观察显示,模型组小鼠胸腺组织皮质和髄质交界模糊,细胞排列紊乱,皮质萎缩;乳痈方各剂量组小鼠的胸腺组织皮质区和髄质边界较明显,皮质区细胞总数较模型组显著增多(P<0.05,P<0.01),髄质区细胞总数较模型组显著减少(P<0.05,P<0.01)。免疫组化检测显示,乳痈方干预后,模型小鼠胸腺组织上皮细胞标记物E-cadherin阳性表达增多,间质细胞标记物Vimentin阳性表达减少。②成功构建iTECs,iTECs与TECs形态相似,且高表达SV40基因和CK5蛋白。MTT检测和结晶紫染色观察显示,100、200、400μg/ml乳痈方干预可促进iTECs增殖(P<0.01)。③TGF-β1诱导后,iTECs逐渐变为长梭形,E-cadherin表达和mRNA水平降低(P<0.05),Vimentin表达和mRNA水平上调(P<0.05),且相关基因Snail 1和Zeb 1的mRNA水平显著升高(P<0.01)。乳痈方干预可抑制TGF-β1诱导的细胞形态向长梭形变化,上调E-cadherin表达和mRNA水平(P<0.01),下调Vimentin表达和mRNA水平(P<0.05,P<0.01),且显著降低Snail 1和Zeb 1的mRNA水平(P<0.01)。④TGF-β1诱导可引起iTECs细胞Smad mRNA水平明显上调(P<0.01),不同剂量乳痈方作用均可使Smad mRNA水平显著下调(P<0.01),且低剂量组的信号通路活化程度较TGF-β1组明显降低(P<0.05)。结论:乳痈方可有效逆转乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞的表型变化,其作用机制与抑制TGF-β1/Smad通路有关。