永生化髁突软骨细胞软骨表型的特征

体外培养的髁突软骨细胞（mandihular condylarchondrocyte,MCC）常表现出不同分化状态的软骨细胞并存,其表型特征也随培养时间而变化,这些不稳定的因素为研究MCC的生物学特性带来了一定的困难。

永生化下颌骨髁突软骨细胞的微囊化研究

为了探讨微囊包裹软骨细胞在软骨组织工程中的适用性 ,根据气流切割原理采用海藻酸钠 -多聚赖氨酸 -海藻酸钠 ( APA)对永生化下颌骨髁突软骨细胞 ( Im mortalized mandibular condylar chondrocyte,IMCC)进行微囊包裹。用倒置显微镜观察、台盼蓝染色、细胞记数、HE染色、免疫组化等方法检测微囊的大小、细胞的生长及微囊内组织的软骨特性等情况。研究发现 ,IMCC可在微囊内存活 ,活细胞率 >80 % ,微囊直径平均 779μm。细胞数量随着培养时间的延长逐渐增多 ,约 2 0 d左右达到平台期 ,细胞在囊内呈簇样生长 ,高表达软骨特异的蛋白多糖和 型胶原。提示 IMCC可在微囊内形成类软骨组织样结构 。

永生化下颌髁突软骨细胞形态学特征的研究

目的 :比较永生化下颌髁突软骨细胞 (IMCC)和原代培养的下颌髁突软骨细胞 (MCC)在形态学特征等方面的差别。方法 :通过相差显微镜、光镜、电镜等观察细胞的形态特征 ,采用HPIAS_10 0 0图像分析系统比较IMCC和MCC的大小。结果 :MCC表现出以多角形为主的多形性形态特征 ,并随培养代数的增加细胞形态发生改变 ;IMCC为多角形 ,传代对其形态无明显影响。MCC的超微结构表现出软骨细胞的一般特征 ,IMCC近似于前成软骨细胞 ,部分细胞核浆比例、细胞核形态发生改变。图像分析发现IMCC在细胞长短径、面积等方面小于MCC(P <0 .0 1)。结论 :IMCC基本保留了MCC的形态特征 ,其表型稳定 ,属于一种分化程度较低、幼稚的软骨细胞 ,可能近似于下颌髁突的增殖层细胞。

具有软骨细胞表型特征的永生化兔髁突软骨细胞系的建立

目的 :建立具有稳定软骨细胞表型特征的永生化兔髁突细胞系。方法 :采用逆转录病毒载体介导的方法将SV40大T抗原基因导入原代培养的兔髁突软骨细胞 ,利用G418筛选阳性克隆并对其进行扩大培养 ,通过RNA点杂交检测转基因细胞I、II型胶原基因的转录。结果 :有一株克隆在体外 1年半稳定传代10 0次以上 ,命名为永生化髁突软骨细胞系 (immortalizedmandibularcondylarchondrocyte ,IMCC) ,点杂交显示IMCC有I、II型前胶原基因的转录。结论 :获得具有稳定软骨细胞表型特征的永生化兔髁突细胞系。

永生化髁突软骨细胞的血清依赖性生长实验

目的 研究永生化髁突软骨细胞（Immortalized mandibular condylar chondrocyte,IMCC）的血清依赖性生长特征。方法将 IMCC和原代培养的躲突软骨细胞（Mandibular condylar chondrocyte,MCC）接种于96孔板,用MTT法比较两种细胞在无血清培养基,含5％、10％和20％血清培养基中的生长情况。结果IMCC和MCC均不能在无血清培养基中生长,但可在含5％血清的培养基中生长,其增殖速度明显低于在10％和20％两种血清浓度中细胞的生长速度,而10％和20％两种血清浓度中细胞的生长速度则较接近。IMCC的生长速度快于MCC。结论IMCC保留了MCC的血清依赖性生长特性,其增殖速度快于MCC,不属于恶性转化细胞。

永生化髁突软骨细胞细胞周期及核型特征的分析

目的 研究永生化髁突软骨细胞 (immortalizedmandibularcondylarchondrocyte,IMCC)的细胞周期及核型特征。方法 收集不同代数的IMCC和第 4代的髁突软骨细胞 (mandibularcondylarchondrocyte ,MCC)分别用流式细胞仪检测两种细胞的细胞周期特征 ,并用染色体显带法观察其核型特征。结果 G1期的MCC和IMCC所占百分比分别是 79.7%和 60 .0 % ,G2期的细胞分别为 6.1%和 2 1.2 % ,S期的细胞分别为 14 .3 %和 18.8%。第 4代MCC和第 60代、第 84代IMCC中有 4 4条染色体的细胞分别占 90 %、5 3 %和 3 1%。结论 IMCC细胞周期发生改变 ,细胞增殖速度加快 ;多数IMCC染色体维持在 4 4条 ,但随着培养次数的增加 。

低强度脉冲超声波对髁突软骨细胞炎症状态的作用研究

目的 观察低强度脉冲超声波对白介素-1β制造的大鼠髁突软骨细胞炎症模型中MAPK信号通路相关因子磷酸化的表达变化。方法 二次酶消化法分离髁突软骨细胞并完成鉴定。将分离出的大鼠髁突软骨细胞随机分为3组,加入3种不同浓度的IL-1β处理并进行Ⅱ型胶原与MMP-13免疫细胞化学染色,筛选出最佳致炎浓度。再次将所提取的大鼠髁突软骨细胞随机分为3组:NC组、OA组、LIPUS组,处理后对Ⅱ型胶原、p38、p-p38、ERK1/2、pERK1/2进行免疫细胞化学染色,观察蛋白表达情况。结果(1)成功提取大鼠髁突软骨细胞。(2)IL-1β:10 ng/mL组Ⅱ型胶原表达量降低最明显,差异有统计学意义(P<0.05),MMP-13表达量升高最明显,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)OA组与LIPUS组Ⅱ型胶原表达量均降低,差异有统计学意义(P<0.05),OA组降低更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。3组的p38、ERK1/2表达量无明显差异(P>0.05)。OA组与LIPUS组p-p38、p-ERK1/2表达量均升高,差异有统计学意义(P<0.05),OA组升高更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论(1)二次酶消化法成功提取大鼠髁突软骨细胞。(2)10 ng/mL为IL-1β最佳致炎浓度。(3)LIPUS处理可减少炎性髁突软骨细胞中Ⅱ型胶原的降解,抑制了MAPK通路相关因子p38、ERK1/2的磷酸化。

Dnmt3b对髁突纤维软骨干细胞多向分化调控作用的实验研究

目的:探究DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase 3b enzyme,Dnmt3b)对大鼠髁突纤维软骨干细胞(fibrocartilage stem cells,FCSCs)成脂、成骨、成软骨向分化能力的影响。方法:体外分离培养大鼠髁突FCSCs,构建Dnmt3b过表达慢病毒,感染FCSCs建立过表达Dnmt3b的FCSCs细胞模型,并对其进行成脂、成骨、成软骨诱导培养,检测Dnmt3b过表达对大鼠髁突FCSCs成脂、成骨、成软骨相关基因表达的影响。结果:大鼠髁突纤维软骨干细胞具有间充质干细胞特性。与对照组相比,Dnmt3b过表达组成脂相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,Ppar-γ)的表达显著降低,成骨相关基因Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的表达显著升高,成软骨相关基因SRY相关转录因子9(SRY-related high mobility group-box gene 9,Sox9)、聚集蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)的表达显著升高。结论:Dnmt3b能促进大鼠髁突纤维软骨干细胞成软骨向分化和成骨向分化,抑制其成脂向分化。

2-APB抑制静压力诱导髁突软骨细胞凋亡的作用及机制研究

目的:探讨TRPM7抑制剂2-APB对静压力诱导的髁突软骨细胞凋亡抑制作用及其机制。方法:通过胰蛋白酶消化法提取大鼠髁突软骨细胞,施加不同条件静压力条件,给予不同条件2-APB干预后,以Flou-3AM荧光探针检测胞内钙离子浓度,以流式细胞术检测细胞凋亡率,以Western Blot检测p38蛋白表达,以RT-PCR检测P38mRNA表达水平。进一步采用p38抑制剂进行干预处理,分析细胞凋亡情况变化。结果:不同压力条件下细胞内钙离子浓度与细胞凋亡率变化趋势高度一致,Pearson相关系数值为0.916(P<0.01),有着显著的正相关关系。2-APB可明显抑制静压力诱导的胞内钙离子浓度增高(P<0.01);2-APB与BAPTA-AM对胞内钙离子浓度抑制效果差异无统计学意义(P>0.05)。2-APB可明显抑制静压力诱导的细胞凋亡率升高及p38蛋白、mRNA高表达(P<0.01)。SB203580可明显抑制静压力诱导的细胞凋亡率升高(P<0.01)。结论:2-APB对静压力诱导的髁突软骨细胞凋亡有抑制作用,其机制可能与抑制TRPM7有关。静压力作用下TRPM7介导的钙离子增高是引发细胞凋亡损伤的途径,p38在其中发挥了重要作用,抑制TRPM7介导的钙离子内流可能成为缓解压力诱导细胞损伤的途径。

静张应力对大鼠髁突软骨细胞增殖效应调节研究

目的 探讨静张应力环境对髁突软骨细胞增殖效应的影响。方法 将第 4代大鼠下颌髁突软骨细胞在细胞膜式张应力施加装置上培养 ,检测不同血清浓度及持续不同的静张应力 (5kPa、10kPa)在 0～ 12h内对髁突软骨细胞增殖活性的影响。结果 低血清培养基中 ,随培养时间的延长 ,硅胶膜上髁突软骨细胞的增殖活性受到抑制 ;短期 (2h)的静张应力 (5kPa、10kPa)对髁突软骨细胞细胞周期的调控影响不大 ;0～ 10h内 5kPa静张应力组软骨细胞增殖指数随着张应力作用时间的延长不断上升 ,增殖指数峰值位于 10h处 ;0～ 8h内 10kPa静张应力组软骨细胞增殖指数随着张应力作用时间的延长不断上升 ,增殖指数峰值位于 8h处 ;5kPa静张应力组较 10kPa静张应力组对髁突软骨细胞具有更大的促增殖作用。

颞下颌关节骨关节病髁状突软骨细胞体外培养及细胞生物学特性研究

目的 :从兔的颞下颌关节骨关节病模型动物获得髁状突软骨细胞并行体外培养。方法 :采用部分关节盘手术切除的方法制造颞下颌关节骨关节病模型 ,组织大体观察、超微结构观察和组化检测方法确定骨关节病的存在。在此基础上 ,通过机械分离、胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方法从骨关节病髁状突软骨组织中获得软骨细胞 ,进行体外环境下的贴壁培养 ;通过软骨细胞特异性蛋白的免疫组化方法进行细胞鉴定。四甲基偶氮唑盐法比较病理模型细胞与正常细胞的增殖能力差异。结果 :上述颞下颌关节骨关节病模型全面地模拟了骨关节病变关节软骨组织的特征 ;利用机械分离、胰蛋白酶胶原酶联合消化的方法成功地从骨关节病髁状突软骨组织中分离出软骨细胞并在体外贴壁条件下培养成活 ;应用特异性的Ⅱ型胶原多克隆抗体和聚合性糖胺多糖单克隆抗体对培养细胞进行免疫组化检测鉴定 ,均显示阳性。骨关节病髁状突软骨细胞的增殖能力高于正常细胞。结论 :成功地建立了骨关节病髁状突软骨细胞的体外模型 ;骨关节病早期的髁状突软骨细胞表现出增殖活跃的特性。

体外周期性单轴压应力作用下大鼠髁突软骨细胞肌动蛋白和中间丝波形蛋白的早期变化研究

目的探讨体外周期性单轴压应力对大鼠髁突软骨细胞细胞骨架蛋白肌动蛋白(Actin)和中间丝波形蛋白(Vimentin)的早期影响。方法利用四点弯曲加力装置对第3代大鼠髁突软骨细胞进行周期性单轴压应力加载,力值为4000μstrain,时间为15、30、60、120、240min。同时设有不加力的对照组。采用免疫荧光技术和Westernblot免疫印迹技术研究大鼠髁突软骨细胞在周期性单轴压应力作用下Actin和Vimentin的早期动态变化。结果在4000μstrain压应力作用下,细胞骨架荧光逐渐下调,60min表达最低,但120min后细胞骨架的荧光表达逐渐恢复。Vimentin蛋白表达水平在30min开始下降,Actin蛋白表达在60min明显下调,几乎消失;但120min后两种蛋白表达水平开始迅速回升。结论4000μstrain压应力刺激对大鼠髁突软骨细胞Actin、Vimentin蛋白的表达存在时间效应性,表现为先下调后反馈增强的趋势,提示细胞对力学刺激的反应存在"自我调控保护"的机制。

雌激素对人胚髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的观察不同浓度的雌激素作用于体外培养的人胚髁突软骨细胞(MCCs),探讨雌激素对MCCs增殖分化的影响。方法体外培养MCCs,甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色法鉴定;甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同浓度雌激素对MCCs增殖与分化的影响。结果高浓度(10-6mol·L-1)、低浓度(10-12mol·L-1)雌二醇抑制MCCs增殖分化,生理浓度(10-10、10-8mol·L-1)雌二醇促进MCCs增殖分化,且随作用时间延长,促进或抑制作用增强。结论雌激素对体外培养的人胚MCCs增殖分化具有双向调节作用,呈时间和剂量依赖性。表明雌激素对维持颞下颌关节的正常功能具有重要意义,可能在颞下颌关节病的发生和进程中发挥作用。

基于永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞的工程化软骨形成的实验研究

目的 :探讨hTERT转染的永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞 (MSCs)裸鼠体内形成软骨的能力。方法 :通过真核表达载体 ,把人端粒酶逆转录酶基因转入兔髁状突软骨细胞 ,筛选并挑选阳性克隆进行扩增培养 ;取兔骨髓 ,密度梯度离心和培养 ,经诱导、扩增后与支架材料 β 磷酸三钙 (β TCP)复合 ,构建细胞 β TCP复合体 ,体外培育 1～ 2d后 ,植入裸鼠体内。通过粘多糖 (GAG)含量和Ⅱ型胶原的表达来检测 3和 6个月复合体软骨形成情况。结果 :两种细胞和 β TCP复合体在裸鼠体内均能形成软骨样组织 ;6个月 ,工程化软骨GAG含量和Ⅱ型胶原的表达均低于正常软骨组织 ,但无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :hTERT转染的永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞均具有良好的软骨形成能力 ,在软骨组织工程修复软骨缺损方面具有重要的应用前景。

大鼠下颌髁突软骨细胞体外培养研究

下颌髁突软骨的生长改建一直是人们关注的焦点。本实验选用ＳＤ大鼠下颌髁突软骨，分离培养髁突软骨细胞，用倒置显微镜、扫描电镜、酶组织化学、免疫组织化学等方法研究了培养髁突软骨细胞的生物学特征。结果：培养的髁突软骨细胞呈多角形或梭形，细胞内有大量分泌颗粒，并有重叠生长和集落生长的特性，它们能合成特异的蛋白多糖、碱性磷酸酶、Ⅱ型胶原等。本研究所介绍的大鼠下颌髁突软骨细胞的分离培养技术及鉴定方法。

负荷改变对髁突软骨细胞合成蛋白多糖的影响

目的 :研究负荷变化对髁突软骨细胞蛋白多糖合成的影响。方法 :拔除成年家兔左下磨牙 ,分别于术后 2周、1月和 3月取双侧颞颌关节 ,进行阿辛兰和甲苯胺兰等组织化学染色和免疫组化染色。结果 :酸性粘多糖和蛋白多糖术后含量均降低 ,以非拔牙侧更显著 ,随着缺牙时间的延长这些变化而更显著。结论 :异常负荷可导致软骨细胞蛋白多糖合成的减少及其构成的变化 ,从而使髁突纤维软骨的粘弹性降低。

人胚髁状突软骨细胞的分离、培养和生物学性状

目的:研究体外培养的正常人胚髁状突软骨细胞的生物学特性.方法:体外培养人胚髁状突软骨细胞,观察其从原代至第6代的形态变化;测定细胞数量的变化及其生长曲线;测定冷冻复苏后的细胞存活;观察细胞的超微结构.结果:从原代至第3代,髁状突软骨细胞为圆形、多角形,从第4代开始逐渐转变为梭形的成纤维细胞.体外培养至第6天髁状突软骨细胞的数量是接种时的3倍.冷冻复苏后经苔盼蓝拒染试验检查,发现细胞存活率为92%.体外培养髁状突软骨细胞的超微结构正常.结论:单层培养髁状突软骨细胞的表型至少能够保持3代稳定,且形态结构正常,具有正常的生长增殖能力,并可经深低温冷冻长期保存.

体内压应力刺激下大鼠髁突软骨细胞的分离、体外培养以及差异蛋白质组学观察

目的:观察体内压应力刺激下大鼠髁突软骨细胞的生物学活性和蛋白质表达谱。方法:对大鼠进行III类矫形力应力加载2周,观察髁状突大体形态和组织形态学;体外培养实验鼠和对照鼠软骨细胞,计数细胞收获数和细胞存活率,检测总蛋白质组学水平上差异。结果:压力刺激后的大鼠髁突软骨明显变薄,表面无光泽,缺乏弹性,重量降低(P<0.01);力学刺激后髁突软骨细胞收获率和存活率均下降(P<0.01),形态更加狭长;蛋白质组学结果主要为应激蛋白上调,信号转导蛋白活化,细胞骨架蛋白和细胞增殖代谢相关蛋白的下降。结论:经体内力学加载后,体外分离培养的关节软骨细胞形态、生物学活性以及在蛋白质水平均发生了明显的变化。

机械压力对大鼠下颌髁突软骨细胞增殖活性影响的体外研究

目的:建立体外培养细胞加力装置,在细胞水平探讨机械力作用下大鼠髁突软骨细胞功能代谢的变化。方法:采用流式细胞术检测不同时段、不同力值的机械压力对体外培养的大鼠髁突软骨细胞增殖活性的影响。结果:在一定时间、0～2.03×10-4Pa(0～207g/cm2)力值范围内,随着机械压力的增大,受压的下颌髁突软骨细胞增殖活性增高,以持续压力作用6h最为明显;当持续压力作用于下颌髁突软骨细胞24h后,细胞增殖活性则出现下降。结论:在一定时间、一定力值范围内,随着机械压力的增大,受压的下颌髁突软骨细胞增殖活性有逐渐增高的趋势;当持续压力作用超过一定的范围。

颞下颌关节髁突软骨细胞体外培养中去分化现象研究

目的 研究去分化髁状突软骨细胞的细胞生物学特性。方法 连续在体外贴壁条件下培养传代正常乳兔髁突软骨细胞至第 2 0代 ,观察培养细胞的形态变化 ,免疫组化法和RT -PCR法对传代过程中的数代细胞对II型胶原与蛋白多糖聚糖体的表达情况进行连续检测 ,观察细胞软骨基质蛋白表达分泌的变化以及发生明显去分化软骨细胞的超微结构特点。结果 在贴壁培养条件下 ,髁状突软骨细胞去分化现象于细胞传代第 3代后逐渐显著 ,第 6代后培养的软骨细胞几乎完全去分化。去分化细胞胞体拉长 ,呈“成纤维细胞”样外观。去分化过程中 ,细胞对软骨基质蛋白的表达水平逐渐降低 ,细胞增殖速度增强。透射电镜观察显示 ,去分化软骨细胞细胞核明显呈分叶状 ,表现出异型核。结论 髁突软骨细胞在体外贴壁培养传代过程中会发生去分化现象 ,丧失软骨细胞特征性细胞表型。