VDAC1基因低表达型Z310细胞系的建立与乙酸铅对其增殖的影响

目的运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制电压依赖性阴离子通道1（voltage—dependent anion channell，VDAC1）在永生化大鼠脑脉络丛Z310细胞中的表达，构建VDAC1基因低表达型Z310细胞系，并检测乙酸铅对其增殖的影响，为进一步研究VDAC1蛋白在乙酸铅对z310细胞毒性机制中的功能和作用提供实验基础。方法利用分子克隆技术构建4种特异性VDAC1-miRNA（GFP）干扰载体，筛选、测序验证并扩增。通过Lipofectamine LTX转染试剂盒将重组质粒转染Z310细胞，转染24h后，以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果。经Blasticidin筛选后，通过实时荧光定量PCR法和蛋白印迹法（Western blotting）检测转染后细胞中靶基因和靶蛋白的表达情况。并采用CCK-8法检测乙酸铅（1、5、10、20、50、100、200和400μmol／L）染毒24h对VDAC1低表达Z310细胞增殖的影响。结果本实验筛选出最有效的干扰载体13MR0047—3—1，与空载体组比，其对靶基因的沉默效率为52．62％；与未处理的Z310细胞组比，其下调了81．28％VDAC1蛋白的表达。CCK-8法结果显示，20μmoL／L以上剂量的乙酸铅可抑制VDAC1低表达Z310细胞的增殖，存在剂量一效应关系；且与相同染毒剂量组的空载体对照Z310细胞比，高剂量乙酸铅（200～400μmol／L）对VDAC1低表达Z310细胞的毒性更大，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论大鼠脑脉络丛永生化Z310细胞电压依赖性阴离子通道1的靶向抑制成功，VDAC1基因低表达型Z310细胞系构建成功。VDAC1的低表达促使Z310细胞对乙酸铅的毒性作用更为敏感，其机制值得进一步研究。

脑脉络丛组织中锰毒性差异表达蛋白的体外验证

目的本实验室前期研究在锰染毒体内实验模型的大鼠脑脉络丛组织中鉴定到32个锰毒性相关的差异蛋白。本试验挑选出其中7个差异表达蛋白,包括抑制素蛋白(PHB1)电压阴离子通道(VDAC)、肌动蛋白β亚型(β-Actin)、应激性磷蛋白1(STI1)、热休克蛋白70(HSP70)、转甲状腺素蛋白(TTR)和中间丝波形蛋白(Vimentin),在大鼠永生化脉络丛上皮Z310细胞体外染锰模型中,对其蛋白和mRNA水平的变化趋势进行验证。方法氯化锰(0、50、100和200μmol/l)染毒Z310细胞24 h,采用蛋白印迹法(Western Blot)测定7个锰毒性相关蛋白的蛋白表达水平;同样剂量的氯化锰染毒Z310细胞12 h,以实时定量逆转录聚合酶链式反应法(Real time-RT PCR)测定7个蛋白在mRNA水平的表达情况。结果随着剂量的增加PHB1、β-Actin和STIP1在蛋白表达与mRNA水平均表现为上调的效应趋势,VDAC、HSP70、TTR和Vimentin在蛋白表达与mRNA水平均表现为下调的效应趋势;PHB1、β-actin、STIP1和TTR在Z310细胞中的表达效应趋势与体内动物模型脑脉络丛中锰毒性差异蛋白的变化趋势相符,而VDAC、HSP70和Vimentin在Z310细胞中的表达效应趋势则与之相反。结论氯化锰对PHB1、β-actin、STIP1和TTR的毒性效应在体内和体外是一致的,染锰后其蛋白表达和mRNA水平的变化趋势是可靠准确的。这为开展锰致脑脉络丛组织及其上皮细胞的毒性效应及其分子机制研究提供了有价值的线索。