非综合征耳聋大家系永生细胞系的建立及几种EB病毒转化外周血淋巴细胞建系方法的探讨

永久保存珍贵的家系材料,是对该家系进行深入研究的基础,为此采用EB病毒(Epstein Barrvirus,EBV)转化淋巴细胞的方法对中国江苏淮阴地区非综合征耳聋大家系行建系工作。该家系患者呈典型的母系遗传特征,且研究发现患者中均具有线粒体DNA12SRNAA1555G突变,是迄今世界上最大的非综合征耳聋家系之一,在该家系的建系过程中使用了4种不同的方法。建系结果分别为:微量全血法1株,冻存全血法1株,冻存白细胞法14株及环孢霉素A(CyA)法36株,共计52株。文章就建系工作及这4种转化方法作一简单探讨。

海南省黎族永生细胞库的建立

采用ＥＢ病毒转化外周血Ｂ淋巴细胞同时加环孢菌素Ａ法，建立了海南黎族永生细胞库。该库共含有５４株“润黎”永生细胞株，供血者均身体健康，且三代无与不同民族或不同支系通婚史。其中男性占５６％，女性占４４％，有亲缘关系者仅占１３％

长寿老人永生细胞库的建立与保存

目的 建立长寿老人永生细胞库 ,为长寿遗传机制的研究提供永久的研究材料。方法 用 EB病毒 (Epstein- Barr virus)转染长寿老人外周血 B淋巴细胞 ,采用 2 0 % FBS RPMI1 640培养液 ,配合环胞霉素 A和 PHA,置 37℃ 5% CO2 培养箱内培养。及时加液或少量换液 ,当细胞增长到一定数量时分瓶传代 ,分瓶传代到 1 6瓶及以上予以冻存 ,之后复苏以证明冻存成功情况。结果 成功地对广西巴马长寿乡壮族长寿家庭的 2 4个个体建立了永生细胞株。其中 ,百岁老人 6株 ,90～ 99岁老人 1 2株 ,长寿老人≤ 66岁的直系亲属 6株。结论 所有建成的细胞株冻存后复苏的成功率为 1 0 0 %。经染色体 G显带分析未见异常 ,表明建立细胞株的方法稳定。

广西巴马长寿乡壮族长寿老人永生细胞库的建立

目的 :建立广西巴马长寿乡壮族长寿老人永生细胞库。方法 :使用 EB病毒转化外周血 B淋巴细胞方法。结果 :建立了长寿者外周血细胞转化永生细胞株的方法 ,转化成功率 77.4 %。建立了 65株长寿老人、直系亲属永生细胞株及长寿老人资料库和完整的细胞株档案。结论 :广西巴马长寿乡壮族长寿老人永生细胞库的建立为永久保存细胞系及后续研究提供了必要的基础。

中国鄂温克、鄂伦春、达斡尔族永生细胞系的建立与保存

本文采用EBV(Epstein BarrVirus)上清液转化B淋巴细胞 ,并加入环胞霉素A(CyclosporineA)抑制T淋巴细胞 ,成功地对中国东北地区鄂温克族、鄂伦春族及达斡尔族的部分个体建立了永生细胞系 ,其中鄂温克族49株 ,鄂伦春族40株 ,达斡尔族51株 ,总计140株。永久保存我国特有民族的基因组 。

建立海南黎族永生细胞库

采用ＥＢ病毒转化外周血Ｂ淋巴细胞加环胞霉素Ａ 法，建立了含５４ 株海南黎族永生细胞库（男性５６％ ，女性４４％ ），有亲缘关系者占１３％ 。供血者身体健康，三代无与其他民族或支系通婚史。

中国10个民族永生细胞系的建立与保存

永久保存我国各少数民族的遗传信息是中国人类基因组计划的重要内容,为此,采用EB病毒(epstein-barrSvirusEBV)上清液及Hepes转化外周血B淋巴细胞,并加入环孢霉素A(cyclosporineA)抑制T淋巴细胞,成功地对中国哈萨克族、满族、朝鲜族、赫哲族、蒙古族、锡伯族、回族、布依族、四川汉族和福建汉族的部分个体建立了永生细胞系。其中哈萨克族64株,朝鲜族58株,赫哲族18株,锡伯族43株,回族63株,布依族67株,满族65株,蒙古族62株,四川汉族51株,福建汉族58株。总计549株。为保存我国各民族遗传资源、分析各少数民族间的遗传学差异及其起源,奠定了材料基础。

中国海南岛3个黎族主要支系永生细胞系的建立与保存

目的:建立侾黎、杞黎、本地黎3个黎族主要支系的永生细胞库。方法:采用EB病毒转化外周血B淋巴细胞并加环胞霉素A抑制T淋巴细胞建立永生细胞系。结果:成功地对侾黎、杞黎、本地黎的部分个体建立了永生细胞系。其中侾黎66株,杞黎76株,本地黎54株,共196株。结论:侾黎、杞黎、本地黎永生细胞库的建立使特有的黎族基因组得到系统地、永久地保存,并为分析其遗传学差异奠定了基础。

中国儿童孤独症家系外周血淋巴细胞永生细胞系的建立

目的试图建立外周血淋巴细胞、永生化细胞系以保存孤独症患者家系特有的基因组资源,为进一步探讨孤独症的发生机理提供材料。方法在知情同意的情况下收集66个原发性孤独症核心家系成员的外周血样品,采用EB病毒转化技术,将外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系;并用遗传学方法检测其建系前后的遗传稳定性。结果建系成功孤独症病例60例,父母成功132例,所有建成的细胞系冻存后复苏成功率100%,染色体核型分析表明建系前后遗传是稳定的。结论本研究建立的孤独症患者永生细胞系,可为进一步研究孤独症的分子水平发病机理提供随时可取的实验材料。

建立不同民族永生细胞株质量控制方法的探讨

目的以建立普米族、独龙族和怒族永生细胞为基础,探讨EB病毒转化细胞、细胞培养、冻存、复苏以及支原体检测等建立永生细胞株的技术要点及质量检测方法。方法采用EB病毒转化技术建立3个民族永生细胞株;培养法和PCR法对细胞株进行支原体污染检测;染色体G显带及核型分析细胞株的遗传稳定性。结果成功建立了3个民族B淋巴细胞永生细胞株,转化率分别为98%、86%和76%。对已建株保存的3个民族的永生细胞进行复苏培养,复苏成活率为100%。支原体污染检测均为阴性。染色体计数和G带分析显示,细胞株经早期传代培养后,仍然保持二倍体特征,未发现染色体结构畸变。结论本研究中传代培养、细胞冻存、细胞复苏和支原体污染防范等一整套技术过程是满足建库要求的。同时为大规模永生细胞库的建立和进行相应的质量监测提供了科学的依据。另外,本研究还对一些影响转化的因素和可能的机理进行了探讨。

建立巴马长寿老人经EBV转染永生细胞株的方法

目的 :建立用 EBV转化长寿人群外周血淋巴细胞永生细胞株 (L CL)的方法。方法 :用 EBV转染 8份百岁以上健康老人 ,2 0份 89～ 99岁健康老人及 8份 6 6岁以下健康人的血样共 36份。采用 2 0 % FBS RPMI16 4 0培养液 ,配合环孢菌素 A、植物血凝素 (PHA) ,置 37℃ 5 % CO2 培养箱内培养。结果 :成功地获得 2 4份永生细胞株 (其中 ,百岁老人 6份 ,89～ 99岁老人 12份 ,6 6岁以下 6份 )。结论 :采血后 2 4～ 4 8h之间接种 ,转化成功率高。转染后 2～ 3周 ,大部分标本出现细胞分裂、变形 ,标志着转化成功。超过 5周仍无细胞分裂者即发生细胞凋亡。PHA有缓解细胞凋亡的作用 ,但不能使细胞分裂。污染是引起转染细胞株凋亡的主要因素。严格的无菌操作、保持培养细胞的适当密度、适时换液、打散较大的细胞克隆团是培养 L CL

中国遗传性耳聋大家系永生细胞系的建立与保存

目的建立我国遗传性耳聋大家系患者永久淋巴母细胞株以研究核基因结构对线粒体DNA突变的修饰效应。方法采用EB病毒转化外周血淋巴细胞同时加环孢霉素A法,建立该大家系永生细胞系,其中患者14例,配偶及正常同胞18例;男性17例,女性15例。结果建株成功率达到90%以上,对已建立的永生细胞株经复苏和冻存的成功率为100%。细胞染色体制备及G显带核型分析正常。结论通过建立永生细胞系保存这一具有重要研究价值的家系遗传资源,为在细胞和分子水平上进一步开展遗传性耳聋的基础研究提供了宝贵的资料。

原发性开角型青光眼家系永生细胞株的建立与保存

目的建立并保存我国重庆地区原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)大家系患者及其亲属永生淋巴细胞株,为进一步深入研究该家系奠定良好基础。方法采用EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)转化外周血淋巴细胞同时加入环孢霉素A(cyclosporin A,CsA)法,建立该家系永生细胞株。结果建株成功率达到92.3%,对已建立的永生细胞株经复苏和冻存的成功率为100.0%。结论成功建立并保存了这一具有重要研究价值的家系遗传资源,为在细胞和分子水平上进一步开展POAG的基础研究提供了宝贵资源。

中国白裤瑶永生细胞库的建立

目的 建立和保存白裤瑶B淋巴母细胞永生细胞株。方法 采用EB病毒转化外周血B淋巴细胞 ,同时加环孢菌素A法。结果 成功地建立了含有 4 4株永生细胞的白裤瑶永生细胞库。供血者身体健康 ,三代均为白裤瑶。结论 建立永生细胞库 ,可永久保存白裤瑶特有的基因组 ,为民族起源、演进和遗传多样性的研究提供细胞资源。

大鼠血管纹边缘细胞永生细胞系的建立

目的建立大鼠血管纹边缘细胞(Marginal Cells,MC)的永生细胞系,为进一步研究MC的功能打下基础。方法取3～5日龄大鼠的耳蜗侧壁组织进行MC的原代培养,经选择性消化、差异性贴壁等手段纯化MC后,将MC和SV40在无血清DMEM条件下共培养三天,经2%新生牛血清选择培养三天,通过形态学的变化及增殖能力的变化粗筛出MC系;通过观察MC系的形态、生长特征,细胞角蛋白18、波形蛋白的免疫细胞化学,RT-PCR检测SV40T抗原、IsK,细胞记数法及流式细胞术分析其生长情况及染色体倍型,软琼脂培养、裸鼠致瘤实验等鉴定MC-C3系。结果MC-C3系基本保持了原代MC的表型特征:多角形外观、细胞间连接紧密,单层时呈“铺路石样”外观,dome形成能力等形态、生长特征;细胞角蛋白18、波形蛋白表达双阳性;不同世代的MC-C3均有SV40T抗原、IsK的表达。MC-C3为二倍体细胞。软琼脂培养和裸鼠致瘤实验阴性。该系目前已培养5月,超过20代,传代时间为4～5天,传代比例为1:2～3。液氮中保存有不同世代的细胞。结论本实验成功的建立了大鼠边缘细胞的永生细胞系,初步鉴定表明MC-C3基本保留了原代边缘细胞的表型特征,又不具有瘤细胞的特征。为边缘细胞功能的研究,特别是电生理、分子生物学方面的研究打下了良好的基础。

男性性腺发育不全患者外周血淋巴细胞永生细胞系的建立

目的 建立男性性腺发育不全患者外周血永生细胞系以保存性腺发育不全患者特有的基因组资源 ,为进一步探讨性腺发育不全的发生机理提供材料。方法 收集 4 0例男性性腺发育不全患者的外周血样品 ,采用EB病毒转化技术 ,把患者外周血B淋巴细胞转化成永生淋巴母细胞系 ;用遗传学方法检测其建系前后的遗传稳定性。结果 建系成功 4 0例 ,所有建成的细胞系冻存后复苏成功率 10 0 % ,核型和DNA分析表明建系前后遗传是稳定的。结论 性腺发育不全患者永生细胞系的建立 ,为进一步研究性腺发育不全导致的不育症分子水平发病机理提供随时可取的实验材料。

贵州布依族淋巴母细胞永生细胞株的研究

目的:建立和保存贵州布依族B淋巴母细胞株。方法:采用EB病毒转化外周血B淋巴细胞,同时加环孢霉素A法。结果:建立了7株永生细胞,供血者身体健康且三代均为布依族。结论:建立永生细胞株可长期保存布依族独特的基因组,为民族起源、演进及遗传多样性等研究提供细胞资源。

东北地区少数民族基因组保存永生细胞库的建立

作者采用ＥＢＶ转化，同时加入环孢霉素Ａ方法，对世居东北地区的鄂温克、鄂伦春和达斡尔３个少数民族建立了淋巴母细胞永生细胞库，共建系９１个。人类基因组多样性研究，是探讨各民族的起源、演进，研究基因突变与遗传病发生的重要组成部分。建立永生细胞库保存少数民族个体基因组，可为今后遗传多样性的研究提供长期的研究资料。