序列特异性引物PCR法检测MN血型基因型

目的 建立MN血型系统基因分型的方法 ,检测人群中MN基因的频率。方法 用快速盐析法抽提样本DNA ,序列特异性引物PCR法检测MN基因。结果 115例汉族人群中MM基因型为 2 5例 ,MN基因型为 6 0例 ,NN基因型为 30例。M基因频率为 0 .4 78,N基因频率为 0 .5 2 2。结论 该方法可以检测MN血型基因型。

PCR-SSP法HLA-A、B基因分型与血清学分型的比较

目的比较聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)进行HLA-Ⅰ类A、B抗原位点分型的准确性,并探讨血清学分型错误发生的原因。方法用PCR-SSP以及单克隆抗体血清学分型技术对HLA-A、B分型并比较。结果34例样本PCR-SSP基因分型无假阳性和假阴性出现。PCR-SSP法与血清学比较,血清学检出错误或漏检率分别为HLA-A位点23.5%,B位点26.5%。血清学发生错误或易混淆的抗原有:A2和A68、A32和A33,B5、B60和61。结论PCR-SSP法进行HLA-A、B抗原等位基因分型具有分辨率高、特异性强、重复性好、实验过程简捷快速、分型结果较血清学更加准确可靠的优点。

PCR-SSP法进行HLA分型的影响因素分析

目的 :探讨DNA模板质量、DNA聚合酶 (Taq)用量对人类白细胞抗原 (HLA)分型结果的影响 ,从而确定PCR 序列特异性引物 (PCR-SSP)技术的更加优化的扩增体系。方法 :采用PCR 序列特异性引物 (PCR-SSP)的方法 ,对山西地区 14 40 0名骨髓供者的血样进行了人类白细胞抗原 (HLA)基因分型 ,回顾性分析DNA模板的纯度、DNA用量、DNA聚合酶 (Taq)酶用量对HLA分型结果的影响。结果 :每个PCR反应的DNA模板量在 3 0ng～ 5 0ng之间时PCR扩增效果最优 ;每个PCR反应所用Taq酶为 0.2 3U时PCR扩增效果最优。结论 :DNA模板量和Taq酶用量是使用PCR-SSP技术进行HLA分型的主要影响因素 ;模板DNA的纯度对实验结果影响不大。

PCR-SSP在HLA低分辨中判型困难或无法判型的常见原因及解决策略

目的分析PCR SSP在HLA低分辨中判型困难或无法判型的常见原因,提出解决办法。方法采用计数统计法、PCR SSP高分辨和基因测序法。对10000名无关供者HLA A、B、DR位点PCR SSP低分辨结果中出现判型困难或无法判型的结果2380份,随机抽取800份进行统计。结果由PCR SSP方法造成的占91.88%;技术操作造成的约占8.12%。PCR SSP在HLA低分辨中判型困难或无法判型的结果中,63.50%模棱两可的结果可通过HLA词典基因频率分析得出结果;3.75%的结果需要高分辨方法;2.50%的结果需要基因测序;27.50%的结果需要用特殊引物鉴别;2.75%的结果需要重做。结论PCR SSP在HLA低分辨中判型困难或无法判型的样本97.25%可通过其他方法进一步得出准确结果。

ABO疑难血型鉴定中应用PCR-SSP法的探讨

目的对ABO疑难血型鉴定中应用PCR-SSP法的临床价值进行探讨。方法选取2015年1月~2016年12月我院收治的225例ABO疑难血型受试者,分别给予PCR-SSP法和血清学定型方法进行检测,对比相关数据差异。结果 PCR-SSP法与血清学定型方法的检测结果比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PCR-SSP法在ABO疑难血型鉴定中临床应用价值高,值得临床输血工作者关注。

羊水细胞ABO血型序列特异性引物-PCR法基因定型研究

目的探讨羊水细胞采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-sequence specific primers,PCR-SSP)法进行胎儿ABO血型基因定型检测的可靠性。方法 28例孕妇羊水细胞采用PCR-SSP法进行胎儿ABO血型基因定型检测,对应胎儿出生后进行ABO血型血清学定型。结果 28份羊水细胞中27份ABO基因定型结果与胎儿出生后血清学定型结果相符。结论 PCR-SSP方法检测羊水细胞ABO基因型能较准确判定胎儿ABO血型,可用于产前胎儿ABO血型检测。

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S418_(1515)。序列分析表明S418_(1515)为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40%,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S418_(1515)转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。

流式磁珠反向SSOP杂交法误判HLA基因型的原因分析(附4例报告)

目前对人类白细胞抗原的基因分型技术有多种,包括序列特异性引物-聚合酶链反应（polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP）,多聚酶链反应序列特异性寡核苷酸探针（PCR-sequence specific oligonucleotide probe,PCR-SSOP）杂交法,基因芯片法和DNA直接测序法（sequence-based typing,SBT）。基于Luminex的流式磁珠反向SSOP杂交法具有快速、高准确率、高通量、重复性好等优点,

PCR法快速检测鸭疫里氏杆菌的研究

根据Gen-Bank中25株鸭疫里氏杆菌(RA)的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,在其高度保守区设计了一对特异性引物,成功地建立了鸭疫里氏杆菌的快速、准确PCR检测方法。RA参考菌株J04(2型)、J07(JX1型)均能扩增出671bp的特异性目的条带,而对鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌、鸭源葡萄球菌的扩增结果均为阴性。PCR产物经EcoRI酶切鉴定得494bp和177bp两个预期条带。最低检出基因组DNA浓度为800fg。用全菌体进行PCR时,本实验室分离鉴定的60株RA均能够扩增出特异性目的条带。25份临床疑似病例的分离菌株的PCR扩增阳性率与生化鉴定率完全一致。该方法表明能从病料组织培养8h的混合菌群中快速、准确地检测到RA,可用于RA的快速诊断和流行病学调查。

采用多对型特异性引物巢式PCR法研究江西省HBV基因型分布及其临床相关性

根据HBV全基因序列的差异≥8％或者S区基因序列差异≥4％可将其分为A、B、C、D、E、F等基因型。HBV基因型的分布具有地域性，东南亚地区慢性乙型肝炎病毒感染者中以B和C基因型为主。在我国，北方地区以C型为主，南方以B型为主。

HLA-Ⅱ血清学分型与微量SSP法基因分型的比较分析

目的验证微量序列特异性引物(SSP)技术进行HLA-Ⅱ类移植配型的准确性并探讨血清学分型错误发生的原因。方法采用聚合酶链反应结合微量SSP技术(简称微量PCR-SSP法)以及单克隆抗体血清学分型技术对血清样品进行HLA分型并比较其结果。结果(1)微量PCR-SSP法检测的110例样本中,99例检出HLA-DR的396个等位基因、11例检出HLA-DQ的22个等位基因,检出10%的单倍型个体;(2)两种方法对比研究发现单克隆抗体血清学分型检出错误或漏检率较高,其误差在DR和DQ分别为38.81%和50.75%;(3)错误发生和易混淆的抗原为:DR15/16、11/12、13/14、8、12和DQ5/6、8/9。结论微量SSP法可以准确检定血清学易漏检和发生错误的抗原等位基因。

同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的方法

本发明提供一种同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的方法，属植物保护领域。根据烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒核苷酸序列分别设计两对特异性引物TB2F／TB2R（检测烟草丛顶病毒）及TVCPF／TVCPR（检测烟草扭脉病毒）。提取植株组织的总RNA后，采用双重RT—PCR的方法，同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒。该发明能有效克服指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术以及总核酸提取法和传统RT—PCR方法的缺点，只用相当于一次普通RT—PCR的时间和试剂，就可以方便、特异、灵敏的同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒。

森林草莓转录因子MYB12基因克隆及蛋白特性分析

采集森林草莓（Fragaria vesca）植株叶片，TRIzol法提取样本总RNA，设计特异性引物RT-PeR扩增转录因子MYB12基因，获得1条约1kb大小的特异性片段，克隆并测序。序列分析表明，该片段序列全长988 nts，含有完整的MYB12基因开放阅读框（ORF），ORF长度为855nts，编码285个氨基酸。

广州地区无偿献血者CD36基因突变的频率调查

目的:本研究旨在调查广州地区无偿献血者中CD36基因的突变频率,填补国内CD36抗原缺失相关的基因突变空白。方法:收集200份健康无偿献血员的血液标本,通过PCR-SSP的方法检测广州地区CD36抗原缺失相关的基因突变频率,统计分析并对比国外报道。结果:在200份血液标本中,一共检测出10个样本产生CD36的基因突变,突变类型、例数和频率分别为:C268T,1例,0.5%;329-330delAC,6例,3.0%;A1237C,3例,1.5%。结论:本课题首次利用PCR-SSP方法检测广州地区无偿献血者CD36基因的突变频率,发现主要突变类型为329-330delAC,其次是A1237C,这与国外报道的主要突变类型,C268T,329-330delAC和949insA有所不同。

江西地区强直性脊柱炎与HLA-B27基因关联性

目的:调查分析江西地区HLA-B27基因与强直性脊柱炎的关联性,探讨其对强直性脊柱炎的诊断意义。方法:选择2007-10/2008-12在南昌大学第一附属医院收治的疑似强直性脊柱炎及其相关疾病的患者1246例。其中323例诊断为强直性脊柱炎,923例为类风湿关节炎等相关疾病患者。另外选取135例完全健康者作为对照组。采用序列特异性引物-聚合酶链方法(PCR-SSP法),对1246例临床疑似强直性脊柱炎患者及135例健康者进行HLA-B27基因检测。观察患者HLA-B27的分布情况,HLA-B27与年龄的关系,以及强直性脊柱炎与HLA-B27之间的关系。结果:1246例疑似强直性脊柱炎患者的HLA-B27总阳性率32.5%;135例健康者的阳性率为3.7%;323例强直性脊柱炎患者的阳性率为91.6%。男性的阳性率及发病率均高于女性(P<0.01),且发病年龄主要集中在青少年时期。强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原的敏感性为91.64%,,特异性为88.19%。结论:HLA-B27基因与强直性脊柱炎呈高度相关性,江西地区强直性脊柱炎与HLA-B27的关联性与文献报道的其他地区基本一致,检测HLA-B27基因对强直性脊柱炎的早期诊断和鉴别诊断具有重要意义。

中国白族、佤族和拉祜族人群MBL基因启动子区SNP的研究

目的:研究中国白族、佤族和拉祜族人群甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因启动子区单核苷酸多态性(SNP)。方法:抽提人外周血白细胞基因组DNA,建立SSP-PCR及PCR-分子灯塔实时分析技术,检测MBL基因启动子区SNP位点-550(G/C,称H/L等位基因)、-220(G/C,X/Y等位基因)和 4+4(C/T,P/Q等位基因),分析其单倍型及基因型频率。结果:从 71例白族、73例佤族和 94例拉祜族人中,分别检出等位基因型LYP/LYP4例(5.6% )、4例(5. 5% )和 2例(2. 1% );HYP/LYQ6例 (8. 5% )、11例(15. 1% )和 12例 (12. 8% );LYP/LYQ21例 (29. 6% )、14例 (19.2% )和 51例 (54. 3% );LXP/LXP1例 (1. 4% )、2例 (2. 7% )和 0例;LYQ/LYQ10例(14. 1% )、14例 (19. 2% )、7例 (7. 4% );LXP/LYQ10例(14. 1% )、13例 (17. 8% )和 15例 (16. 0% );HYP/LYP4例(5. 6% )、3例(4. 1% )和 4例(4. 3% );HYP/LXP3例(4. 2% )、1例(1. 4% )和 0例;HYP/HYP12例(16. 9% )、11例(15. 1% )和 3例(3. 2% )。结论:中国白族、佤族、拉祜族普通人群之间,MBL基因启动子区等位基因L/H的分布存在差异(P<0. 01),X/Y和P/Q无统计学意义的差异(P>0. 05);各单倍型和各基因型的分布存在差异(P<0. 01);基因型LYP/LYQ和LXP/LYQ在 3个民族均有较高的分布,其总体频率分别达 36. 1%及 16.

天敌对烟粉虱捕食作用的SCAR标记检测

以烟粉虱和捕食性天敌为研究对象,采用特征序列扩增区域(SCAR)标记法,通过对目的片段的克隆与测序设计烟粉虱特征片段扩增引物,检验该引物的种、虫态及性别特异性,并利用该引物检测捕食性天敌对棉田烟粉虱的捕食作用。研究结果表明,利用SCAR标记法获得了长度为347bp的烟粉虱特异性片段(GenBank登录号为AY841800),根据此片段的碱基序列设计烟粉虱特异引物1对TB-F/TB-R94585,其扩增片段约为240bp;种特异性检验结果表明,该引物只对烟粉虱具有扩增能力,对温室粉虱及其它相关种类不具有扩增效果;同时该引物对不同虫态、不同性别的烟粉虱具有同样的扩增效应。田间检测结果表明,同种天敌昆虫幼体捕食作用检出率高于成虫;在所检测的4类群9种捕食性天敌中,龟纹瓢虫幼虫、异色瓢虫幼虫、草蛉幼虫及东亚小花蝽成虫和蜘蛛对烟粉虱捕食作用的检出率高于50%。

中国人群人类白细胞抗原A、B和DRB1基因测序分型中模棱两可等位基因的鉴别

背景:人类白细胞抗原基因测序分型中,当某些等位基因间的差异碱基位于测序范围外时,无法得到清晰的等位基因结果。目的:分析中国人群人类白细胞抗原A、B、DRB1基因测序分型中模棱两可等位基因的分布规律,探讨其在中华骨髓库大样本人类白细胞抗原A、B、DRB1基因的测序分型中的解决方案。设计、时间及地点:采用随机抽样方法对研究样本进行人类白细胞抗原A、B、DRB1基因的测序分型,并对其中的模棱两可等位基因进行验证性实验,于2006-01/2008-06在深圳市血液中心完成。材料:658名深圳骨髓库汉族供者乙二胺四乙酸盐抗凝血5mL。方法:采用聚合酶链式反应--测序分型方法对658名深圳骨髓库供者的人类白细胞抗原A、B和DRB1基因进行高分辨分型,并采用针对相应位点的高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物方法对其中由于碱基差异位于检测区外而产生的模棱两可等位基因进行鉴别。主要观察指标:模棱两可等位基因的分布及确认。结果:658份标本中,人类白细胞抗原A、B和DRB1三个基因座的模棱两可等位基因分别为9个(2种)、140个(5种)、406个(8种),占等位基因总数的14.06%(555/3948)。高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物鉴定结果显示,中国报道的DRB1*1401被全部确认为DRB1*1454;12例B*0705/B*0706中,有1例被确认为B*0706,其他13种等位基因的鉴定结果分别为A*6801、A*7402、B*2705、B*3501、B*4402、B*5801、DRB1*0101、DRB1*0406、DRB1*0803、DRB1*1101、DRB1*1201、DRB1*1302和DRB1*1502。结论:在中华骨髓库大样本人类白细胞抗原基因的测序分型中可以应用直接鉴别的方法区分模棱两可等位基因,但在临床移植前的高分辨确认试验中则需要采用实验方法进行精确分型。

2例B(A)血型的鉴定

目的对2例标本B(A)血型进行鉴定。方法运用血型血清学、PCR-序列特异性引物(sequence specificprimer,SSP)基因定型和ABO基因第6及第7外显子直接测序的方法,对2例标本的B(A)血型和B(A)型等位基因进行检测。结果 2例标本血清学定型分别为A2B和AxB,PCR-SSP法初筛均为B/O基因型,DNA序列分析测定标本1基因型为B(A)02/O02型,标本2基因型为B(A)02/O01型。结论采用DNA序列分析法才能准确测定华北地区汉族人群中B(A)血型,PCR-SSP法可能引起差错。