汉黄芩素干预糖尿病脑梗死模型大鼠的神经损伤

背景:汉黄芩素是黄芩根中提取的一种黄酮类化合物,既往研究表明汉黄芩素对脑缺血再灌注损伤有保护作用,还能降低糖尿病小鼠的血糖及其并发症,但其在糖尿病脑梗死中的作用及机制还不清楚。目的:探究汉黄芩素对糖尿病脑梗死大鼠神经损伤的影响,并探究其作用机制。方法:将SD大鼠随机分为6组:对照组、模型组、汉黄芩素低、中、高剂量组和汉黄芩素高剂量+RhoA激活剂组,每组10只。除对照组外,其余组通过腹腔注射链脲佐菌素和大脑中动脉闭塞法构建糖尿病脑梗死大鼠模型,汉黄芩素低、中、高剂量组分别灌胃10,20,40 mg/kg汉黄芩素,汉黄芩素高剂量+RhoA激活剂组灌胃40 mg/kg汉黄芩素并腹腔注射10 mg/kg溶血磷脂酸,对照组和模型组给予等量生理盐水,1次/d,连续7 d。末次给药结束后,各组大鼠进行神经功能缺损评分,检测血糖水平,TTC染色检测脑梗死体积,苏木精-伊红染色观察脑组织病理变化,ELISA试剂盒检测脑组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和丙二醛、超氧化物歧化酶水平,Western blot检测脑组织中RhoA、ROCK2蛋白表达。结果与结论:(1)与对照组相比,模型组大鼠神经元结构严重受损,细胞坏死、变性;神经功能缺损评分、血糖水平、脑梗死体积升高(P<0.05);脑组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、丙二醛水平升高(P<0.05),超氧化物歧化酶水平下降(P<0.05);脑组织中RhoA、ROCK2蛋白表达升高(P<0.05);(2)与模型组相比,汉黄芩素低、中、高剂量组神经元损伤改善,细胞变性和坏死减少;神经功能缺损评分、血糖水平、脑梗死体积下降(P<0.05);脑组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、丙二醛水平下降(P<0.05),超氧化物歧化酶水平升高(P<0.05);脑组织中RhoA、ROCK2蛋白表达下降(P<0.05);(3)与汉黄芩素高剂量组相比,汉黄芩素高剂量+RhoA激活剂组明显抑制糖尿病脑梗死大鼠上述指标的改善(P<0.05)。结果表明:汉黄芩素能够改善糖尿病脑梗死大鼠血糖水平,减轻脑梗死和神经损伤,其作用机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

汉黄芩素通过调节Hedgehog-YAP信号通路减轻肝硬化大鼠的肝纤维化

目的:探讨汉黄芩素(Wog)对肝纤维化模型大鼠的影响及其机制。方法:将大鼠分为对照组,模型组,Cym组(Hedgehog抑制剂组),Wog低、中、高剂量组。检测各组大鼠血清肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)水平,肝纤维化指标透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、层黏蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平;天狼星红染色观察肝组织胶原纤维;RT-qPCR法检测肝组织Ⅰ型胶原(ColⅠ)、α-肌动蛋白(α-SMA)mRNA水平;检测肝组织羟脯氨酸(Hyp)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;免疫印迹检测Hedgehog-YAP通路相关蛋白SMO、GLI2、SHH、Yes相关蛋白1(YAP)、p-YAP水平。结果:与对照组相比,模型组血清ALT、AST、GGT、HA、CⅣ、LN、PCⅢ水平和肝组织ColⅠ、α-SMA mRNA、Hyp、MDA、SMO、GLI2、SHH、p-YAP/YAP水平均升高,SOD水平降低;与模型组相比,Cym组和Wog低、中、高剂量组血清ALT、AST、GGT、HA、CⅣ、LN、PCⅢ水平和肝组织ColⅠ、α-SMA mRNA、Hyp、MDA、SMO、GLI2、SHH、p-YAP/YAP水平均降低,SOD水平均升高;其中Cym组与Wog高剂量组相比,上述指标无显著差异。对照组肝组织未见增生的纤维组织,模型组肝组织胶原纤维增生明显,胶原染色面积增大;与模型组相比,Cym组和Wog低、中、高剂量组肝组织胶原纤维增生程度均减轻,胶原染色面积减小;其中Cym组与Wog高剂量组相比,胶原纤维增生程度无显著差异。结论:Wog可减轻肝纤维化模型大鼠肝纤维化程度,对肝纤维化模型大鼠具有保护作用,其机制可能与Wog可抑制Hedgehog-YAP信号通路有关。

汉黄芩素通过调控miR-451/PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信号通路改善低氧诱导的肺动脉高压

目的:评价汉黄芩素对低氧诱导的肺动脉高压(HPH)的保护作用及其相关分子机制。方法:在体内采用成年雄性野生型C57BL/6小鼠建立HPH模型,将小鼠随机分为3组:对照组(N)、低氧(H+Saline)组、低氧+汉黄芩素(H+w)组。造模3周后,使用压力传感器系统采集小鼠血流动力学指标;肺小动脉管壁直径/管总直径(WT/TT)、肺小动脉管壁面积/管总面积(WA/TA)来评估肺动脉结构重塑;基于网络药理学方法筛选汉黄芩素作用于HPH潜在靶点及分子信号通路。在体外采用小鼠肺动脉平滑肌细胞(MPASMCs),将细胞分为5组:常氧(N)组、低氧(H+PBS)组、低氧+低剂量汉黄芩素(H+40μmol/L w)组、低氧+高剂量汉黄芩素(H+80μmol/L w)组、低氧+高剂量汉黄芩素+740Y-P(H+80μmol/L w+740Y-P)组。N组在常氧(5%CO_(2),21%O_(2),74%N2,37℃)环境中培养48 h,H+PBS、H+40μmol/L w、H+80μmol/L w、H+80μmol/L w+740Y-P组在低氧(5%CO_(2),3%O_(2),92%N2,37℃)环境中培养48 h。通过CCK-8、Ed U法检测评估细胞增殖能力,Transwell和伤口愈合/划痕实验用于检测评估细胞迁移能力,Western blot检测PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信号通路的主要蛋白(P-PI3K、PI3K、P-AKT、AKT、RXRA、Bcl-2)的表达,并利用PI3K通路激活剂740Y-P进行功能回补实验;RT-q PCR检测汉黄芩素对miR-451表达水平的影响,Western blot检测汉黄芩素对PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2通路上游调控因子CAB39和MIF表达的影响。结果:与对照组相比,低氧组MPASMCs的增殖、迁移能力以及小鼠右心室压力(RVSP)显著增加(P<0.05),肺动脉结构发生显著重构,经汉黄芩素干预后MPASMCs的增殖、迁移能力以及小鼠RVSP显著下降(P<0.05),肺动脉结构重塑得到显著改善。与对照组相比,低氧组中PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信号通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT、RXRA、Bcl-2表达显著升高;与低氧组相比,汉黄芩素干预组中PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信号通路相关的蛋白表达水平显著下调(P<0.05);功能回补实验证实在缺氧条件下,激活PI3K通路能够显著削弱汉黄芩素对MPASMCs增殖抑制效应。与对照组相比,低氧组中CAB39和MIF表达水平显著上升,miR-451表达水平显著减少(P<0.05);与低氧组相比,汉黄芩素干预组中CAB39和MIF表达水平显著下降,miR-451表达水平显著上升(P<0.05);miR-451 inhibitor干预能够部分逆转汉黄芩素对MPASMCs增殖和迁移能力的抑制效应(P<0.05)。结论:汉黄芩素可能通过上调mi R-451的表达靶向调控CAB39和MIF进而抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信号通路,抑制低氧诱导的MPASMCs的增殖和迁移、改善HPH小鼠右心室压力和肺动脉结构重塑,最终缓解肺动脉高压。

汉黄芩素对青光眼小鼠视网膜神经节细胞的保护作用及其机制研究

目的观察汉黄芩素对青光眼小鼠视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用,并探究其相关作用机制。方法10只(10眼)C57BL/6J小鼠作为对照组;40只(40眼)DBA/2J小鼠用于制备青光眼模型,并分为模型组和实验1、2、3组,每组各10只。对照组、模型组小鼠灌胃生理盐水,实验1、2、3组小鼠分别灌胃50、100、150 mg·kg^(-1)汉黄芩素。以小鼠右眼为入选眼,比较各组小鼠灌胃前和灌胃2周、4周、8周眼压;苏木素-伊红染色并比较各组小鼠RGC数量、视网膜厚度;比色法检测各组小鼠视网膜组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)水平;酶联免疫吸附法检测各组小鼠视网膜组织白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;Western blot检测各组小鼠视网膜组织核苷酸寡聚化结构域样受体家族3(NLRP3)、半胱天冬酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的蛋白表达水平。结果灌胃前,与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠眼压均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。灌胃2周、4周、8周:与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠眼压均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验1、2、3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验1组相比,实验2、3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均降低,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验1、2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均增加,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与实验1组相比,实验2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均增加,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均增加,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、ASC蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论汉黄芩素可改善青光眼小鼠视网膜厚度,缓解视网膜组织氧化损伤和炎症反应,其作用机制可能与抑制NLRP3炎性小体激活有关。

汉黄芩素对胶原诱导性关节炎大鼠关节炎症影响的内质网应激途径

背景:类风湿关节炎是一种炎性疾病,已有多项研究表明汉黄芩素具有较好的抗炎作用,但其对类风湿关节炎的确切疗效和具体作用机制尚待阐明。目的:探讨汉黄芩素通过调节内质网应激途径改善胶原诱导性关节炎大鼠关节炎症的作用机制。方法:①动物水平:雌性Wistar大鼠分为健康对照组、关节炎模型组、汉黄芩素治疗组,通过皮下注射牛Ⅱ型胶原与弗式佐剂构建胶原诱导性关节炎大鼠模型,治疗组在成功造模后给予连续28 d汉黄芩素灌胃治疗;在此期间,每隔7 d对各组大鼠进行体质量、关节炎评分和踝关节肿胀度测量;实验结束后,观察关节病理变化,qRT-PCR和Western Blot、免疫组化检测关节中内质网应激通路GRP78、CHOP mRNA和蛋白表达水平。②细胞水平:CCK-8检测汉黄芩素对胶原诱导性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞的细胞毒作用;不同浓度汉黄芩素处理毒胡萝卜素诱导的成纤维样滑膜细胞,ELISA检测细胞上清白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平,DCFH-DA探针法测定各组细胞内活性氧簇,qRT-PCR和Western Blot检测GRP78、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA和蛋白水平。结果与结论:①与健康对照组相比,关节炎模型组关节炎指数评分、踝关节肿胀度升高(P<0.01),病理切片可见滑膜增生及炎症细胞浸润、软骨破坏和骨质侵蚀,踝关节GRP78、CHOP mRNA和蛋白表达显著增多(P<0.01),主要定位在滑膜组织和关节面;与关节炎模型组相比,汉黄芩素治疗组关节炎指数评分、踝关节肿胀度降低(P<0.05),滑膜增生及炎症细胞减少,软骨破坏和骨质侵蚀减轻,踝关节GRP78、CHOP mRNA和蛋白表达减少(P<0.05),在滑膜组织和关节面显著降低;3组大鼠体质量无显著差别(P>0.05)。②细胞实验中,200μmol/L汉黄芩素组可明显降低成纤维样滑膜细胞存活率(P<0.01);与空白对照组相比,毒胡萝卜素组细胞上清白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平、活性氧含量、GRP78、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA及蛋白表达显著增多(P<0.05);与毒胡萝卜素组相比,50μmol/L和100μmol/L汉黄芩素组可降低细胞上清白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平(P<0.05,P<0.01),100μmol/L汉黄芩素组可明显减少活性氧含量(P<0.01)、下调GRP78、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA及蛋白表达水平(P<0.05)。③结果提示汉黄芩素可以有效改善胶原诱导性关节炎大鼠的关节炎症反应,且内质网应激途径可能是其干预的关键靶点。

汉黄芩素调节Hippo/YAP信号通路对肝硬化大鼠肝纤维化的影响

目的初步探讨汉黄芩素(Wogonin,Wog)调节河马(Hippo)/Yes-相关蛋白(Yes associated protein,YAP)信号通路对肝硬化大鼠肝纤维化的影响。方法将大鼠分为空白对照组(腹腔注射等量生理盐水+灌胃等量生理盐水)、模型组(腹腔注射等量生理盐水+灌胃等量生理盐水)、阳性对照组(0.8 g/kg复方鳖甲软肝片溶液灌胃)和Wog低、中、高剂量组(7、14、28 mg/kg Wog腹腔注射),每组12只。除空白对照组外,其余各组腹腔注射四氯化碳溶液构建肝硬化模型。所有大鼠造模后给药干预,连续4周。检测大鼠血清肝功能指标谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,AST)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,ALT);ELISA法检测血清纤维化指标Ⅲ型前胶原(typeⅢprocollagen,PCⅢ)、透明质酸(hyaluronic acid hyaluronan,HA)、层粘连蛋白(laminin,LN);HE、Masson及免疫组织化学染色法观察肝硬化大鼠肝纤维化程度;Ishak评分判断肝组织纤维化程度,分析胶原体积分数(collagen volume fraction,CVF)及Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ)和Ⅲ型胶原(collagen-Ⅲ,COL-Ⅲ)阳性表达;Western blot检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及Hippo/YAP信号通路蛋白表达水平。结果与空白对照组比较,模型组AST、ALT、PCⅢ、HA、LN、Ishak评分、CVF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1表达升高(P<0.05),p-大肿瘤抑制因子1(large tumor suppressor gene 1,LATS1)/LATS1、p-YAP/YAP表达降低(P<0.05);与模型组比较,Wog低、中、高剂量组及阳性对照组AST、ALT、PCⅢ、HA、LN、Ishak评分、CVF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1表达降低(P<0.05),p-LATS1/LATS1、p-YAP/YAP表达升高(P<0.05)。Wog各剂量组AST、ALT、PCⅢ、HA、LN、Ishak评分、CVF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1水平均随剂量升高而降低(P<0.05);p-LATS1/LATS1、p-YAP/YAP水平随剂量升高而升高(P<0.05)。结论Wog可能通过抑制Hippo/YAP信号通路的激活,改善肝硬化大鼠肝纤维化。

汉黄芩素调节Hippo/YAP信号通路对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

目的:探究汉黄芩素调节Hippo/Yes相关蛋白(YAP)信号通路对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌纤维化的影响。方法:采用腹腔注射阿霉素的方式构建大鼠CHF模型,成功造模36只大鼠,将其随机分为模型组、汉黄芩素组(汉黄芩素100 mg/kg)、汉黄芩素+维替泊芬组(100 mg/kg汉黄芩素+100 mg/kg维替泊芬),每组12只。剩余12只大鼠作为对照组。采用彩色多普勒超声系统检测各组大鼠心功能参数:左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD);称重并计算各组大鼠心脏质量指数(HMI)和左心室质量指数(LVMI);酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;Masson染色法检测大鼠心肌胶原容积分数(CVF)和血管周围纤维面积和血管管腔面积比值(PVCA/LA);苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠心肌组织病理学变化;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测大鼠心肌组织Hippo/YAP信号通路相关蛋白、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、结缔组织生长因子(CTGF)表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠LVEF、LVFS、心肌组织SOD水平及哺乳动物ste-20样激酶(MST)1/2、大型肿瘤抑制因子(LATS)1/2磷酸化水平明显降低(P<0.05),LVEDD、LVESD、HMI、LVMI、心肌组织MDA水平、CVF、PVCA/LA、心肌组织YAP、MMP-2、MMP-9、CTGF蛋白表达明显升高(P<0.05),心肌组织出现大量胶原纤维沉积和损伤。与模型组相比,汉黄芩素组LVEF、LVFS、心肌组织SOD水平、MST1/2、LATS1/2磷酸化水平明显升高(P<0.05),LVEDD、LVESD、HMI、LVMI、心肌组织MDA水平、CVF、PVCA/LA、心肌组织YAP、MMP-2、MMP-9、CTGF蛋白表达明显降低(P<0.05),心肌组织胶原纤维沉积和损伤减少。维替泊芬增强了汉黄芩素对CHF大鼠心肌纤维化的改善作用。结论:汉黄芩素可能通过激活Hippo/YAP信号通路、抑制YAP表达来减轻CHF大鼠心肌纤维化。

汉黄芩素通过NRF2/HO-1信号途径诱导大鼠CIA-FLS细胞铁死亡

目的:探讨汉黄芩素(WOG)通过核因子E2相关因子2(NRF2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号途径诱导胶原诱导性关节炎大鼠成纤维细胞样滑膜细胞(大鼠CIA-FLS细胞)铁死亡的机制。方法:将大鼠CIA-FLS细胞分为:对照组、低、中、高剂量(25、50和100μmol/L)汉黄芩素组、铁死亡抑制剂(LIP-1)组、LIP-1+高剂量汉黄芩素组、HO-1激动剂钴原卟啉(COPP)组和COPP+高剂量汉黄芩素组,CCK-8法检测细胞活力;结晶紫染色法检测细胞形态;检测氧化应激标志物谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)的含量,Western blot检测Kelch样ECH关联蛋白1(KEAP-1)、NRF2和HO-1蛋白表达水平。结果:与正常对照组相比,给予WOG处理后,大鼠CIA-FLS细胞活力显著下降(P<0.01),氧化应激水平显著上升(P<0.01),ROS含量显著增加(P<0.01),NRF2和HO-1蛋白表达水平显著下降(P<0.01),KEAP-1水平显著增加(P<0.01);与WOG组相比,LIP-1处理组的细胞活力显著上升(P<0.01),氧化应激水平显著下降(P<0.01),ROS含量显著减少(P<0.01);与WOG组相比,加入COPP后,NRF2和HO-1蛋白表达水平显著上升(P<0.01),KEAP-1水平显著下降(P<0.01)。结论:WOG能通过NRF2/HO-1信号途径,促进氧化应激来诱导大鼠CIA-FLS细胞铁死亡。

基于网络药理学方法探析汉黄芩素治疗肝细胞癌作用机制和体外实验研究

背景肝细胞癌是癌症相关死亡的主要原因,目前的防治形势依然严峻,对新的肝细胞癌治疗药物进行探索研究具有科学意义。目的通过网络药理学方法分析汉黄芩素干预肝细胞癌的作用机制,并进行体外实验验证。方法在TCMSP数据库中检索汉黄芩素的药物靶点,从TTD、Gen Card、OMIM、Dis Gent数据库中收集肝细胞癌的疾病靶点。将收集的药物靶点和疾病靶点取交集,作为药物干预疾病的潜在靶点。对交集靶点运用R软件进行富集分析,使用STRING数据库和Cytoscape软件对交集靶点构建蛋白互作网络和筛选核心靶点。在GIEPA数据库对核心靶点行进一步分析。最后通过体外实验对前期分析结果进行验证:采用CCK-8试剂盒测定细胞活性;采用平板克隆形成实验测定细胞增殖;采用划痕实验测定细胞迁移;采用Western-blotting(WB)实验测定蛋白质表达水平。结果分析结果发现汉黄芩素的吸收、分布、代谢、排泄特性符合小分子药物成药规则并且毒性分析结果表明无毒性。收集到汉黄芩素靶点135个,肝细胞癌靶点8238个,两者交集靶点113个。通过对构建的蛋白互作网络筛选出的前10位的核心基因进行分析,发现细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC)在肝细胞癌组织中m RNA水平较正常肝组织上调(P<0.05),并且在肝细胞癌患者中高表达与不良预后相关(P<0.05)。KEGG富集分析发现交集基因富集在PI3K/AKT信号通路上最多,分子对接结果显示汉黄芩素与CDK1、SRC结合构型活力较强。CCK-8试剂盒检测结果显示,加入汉黄芩素75.0、150.0、300.0μmol/L组Hep G2细胞活性均低于对照组(P<0.05);平板克隆形成实验结果显示,加入汉黄芩素37.5、75.0、150.0μmol/L组Hep G2细胞克隆形成数均低于对照组(P<0.05);划痕实验结果表明,加入汉黄芩素37.5、75.0、150.0μmol/L组Hep G2细胞迁移率均低于对照组(P<0.05);WB实验结果表明,加入汉黄芩素75.0、150.0μmol/L组PI3K、P-AKT/AKT、CDK1、SRC蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05)。结论汉黄芩素通过下调CDK1、SRC蛋白表达,减弱PI3K/AKT通路信号,抑制肝癌细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡,从而达到干预肝细胞癌发生和进展的目的。

汉黄芩素促进自身免疫性肝炎模型大鼠Th17/Treg细胞平衡

目的探讨汉黄芩素(WG)对自身免疫性肝炎(AIH)大鼠Th17/Treg细胞平衡的影响。方法随机选出10只大鼠作为对照组,其余大鼠通过尾静脉注射伴刀豆球蛋白A(ConA,12.5 mg/kg)溶液构建AIH模型大鼠。将造模成功大鼠随机平分为AIH组、L-WG组(10 mg/kg)、M-WG组(20 mg/kg)、H-WG组(30 mg/kg)、H-WG+VPA组[30 mg/kg WG+300 mg/kg Notch信号通路激活剂丙戊酸(VPA)],每组10只,每天给药1次,持续10 d。ELISA检测血清中炎性因子及肝功能指标;HE染色观察肝脏组织病理形态;流式细胞测量术检测脾脏Th17/Treg细胞水平;Western blot检测脾脏类视黄酸相关孤儿受体γt(RORγt)、叉头框蛋白P3(Foxp3)以及肝组织Notch信号通路蛋白质的表达。结果对照组大鼠肝组织结构正常,染色清晰;AIH组大鼠肝组织细胞出现水肿,细胞体积增大导致肝窦受压变窄,出现大量炎性细胞浸润以及少量坏死现象。AIH组较对照组丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性、白介素(IL)-17和IL-23含量、Th17细胞水平、Th17/Treg、RORγt、Notch、hes家族bHLH转录因子1(HES1)、含YRPW基序的bHLH转录因子hes相关家族1(HEY1)蛋白表达均显著上升(P<0.05),IL-10和TNF-β含量、Treg细胞水平、Foxp3蛋白水平均显著下降(P<0.05);与AIH组相比,L-WG组、M-WG组、H-WG组肝损伤情况得到改善,ALT、AST活性、IL-17和IL-23含量、Th17细胞水平、Th17/Treg、RORγt、Notch、HES1、HEY1蛋白表达均显著降低(P<0.05),IL-10和TNF-β含量、Treg细胞水平、Foxp3蛋白水平均显著升高(P<0.05);VPA逆转了H-WG对AIH大鼠的改善效果。结论WG可能通过下调Notch信号通路促进AIH大鼠Th17/Treg细胞平衡。

基于高效液相色谱法的儿童清肺丸中汉黄芩苷含量测定

目的采用高效液相色谱法建立儿童清肺丸中汉黄芩苷的含量测定方法,以期为儿童清肺丸的质量控制提供参考。方法采用高效液相色谱法测定儿童清肺丸中汉黄芩苷含量,色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C 18(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液(27∶73),流速为1.0 ml/min,检测波长为276 nm,柱温为30℃,进样体积为10μl。结果该方法的精密度、稳定性、重复性均符合要求,汉黄芩苷在9.92~74.40μg/ml(r=0.9998)范围内与峰面积呈良好线性关系,平均加样回收率为100.92%,RSD为1.08%(n=9),6批儿童清肺丸中汉黄芩苷含量在0.55~0.64 mg/g范围内。结论基于高效液相色谱法建立的儿童清肺丸中汉黄芩苷含量测定方法操作简便、精密、准确、专属性强,可作为儿童清肺丸中汉黄芩苷的质量控制方法。

汉黄芩素调节AMPK/SIRT1信号通路对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响

目的 探究汉黄芩素(WOG)调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)信号通路对骨质疏松(osteoporosis,OP)大鼠骨折愈合的影响。方法 将60只SPF级SD雌性大鼠随机分为假手术组(Sham组)、骨质疏松性骨折(OPF)模型组(Model组)、低剂量WOG组(WOG-L组,50mg/kg)、高剂量WOG组(WOG-H组,100 mg/kg)和高剂量WOG+AMPK抑制剂Compound C组(WOG-H+CC组,100 mg/kg WOG+0.2 mg/kg Compound C),每组12只。Model组、WOG-L组、WOG-H组、WOG-H+CC组采用双侧卵巢切除术与右侧股骨干骨折髓内固定术构建骨质疏松性骨折(OPF)大鼠模型。放射性检查评估骨折愈合情况。采用双能X线骨密度扫描仪检测大鼠股骨痂骨密度(BMD)。通过三点弯曲实验和压缩实验对大鼠股骨骨生物力学进行检测。比色法检测大鼠血清骨钙素(OC)、I型前胶原羧基端肽(PICP)水平。HE染色观察骨折处骨痂的病理学变化。Western blot法检测股骨组织中AMPK/SIRT1信号通路相关蛋白表达。结果 与Sham组相比,Model组大鼠骨折愈合评分、股骨上、下端骨痂BMD、骨痂最大位移、最大应力和最大负荷、血清OC、PICP水平、股骨组织中AMPK磷酸化水平、SIRT1蛋白表达显著降低(P <0.05),骨折端未见骨痂生长,骨折线清晰,骨小梁较细,数量减少,间隙增大,结构紊乱疏松。与Model组相比,WOG-H组大鼠骨折愈合评分、股骨上、下端骨痂BMD、骨痂最大位移、最大应力和最大负荷、血清OC、PICP水平、股骨组织中AMPK磷酸化水平、SIRT1蛋白表达显著升高(P <0.05),有连续性骨痂包绕贯穿于骨折端,髓腔再通,骨折线模糊不清,骨小梁形态较完整。Compound C减弱了WOG对OPF大鼠骨折愈合的促进作用。结论 WOG可能通过激活AMPK/SIRT1信号通路促进OPF大鼠的骨折愈合。

基于PI3K/AKT信号通路探讨汉黄芩素对宫颈癌HeLa细胞移植瘤抑制作用影响

目的探究汉黄芩素对宫颈癌HeLa细胞移植瘤的抑制作用及机制。方法随机选取2018年1月—2020年12月常熟市中医院的50只Balb/c小鼠进行宫颈癌荷瘤模型造模,随机分为5组:模型对照组、阳性对照组、小剂量组、中剂量组及大剂量组。模型对照组不做特殊处理,阳性对照组腹腔注射25 mg/kg环磷酰胺,小剂量组、中剂量组、大剂量组小鼠灌胃25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg汉黄芩素。处死小鼠取出瘤体,比较各组肿瘤质量、体积,计算肿瘤生长抑制率;取出胸腺、脾脏并计算相关脏体指数。将小鼠肿瘤分为两份,一份采用伊红-美兰(HE)染色进行组织学观察;另一份采用免疫印迹法检测各组小鼠PI3K、AKT、p-AKT表达情况。结果阳性对照组的肿瘤生长抑制率为69.63%,大剂量组、中剂量组、小剂量组的肿瘤生长抑制率分别为77.78%、54.81%和31.85%均高于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。大剂量组肿瘤生长抑制率为77.78%高于阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹法结果显示,与模型对照组比较,大剂量组、中剂量组与小剂量组PI3K、AKT及p-AKT蛋白表达均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量组与阳性对照组PI3K、AKT和p-AKT表达量接近,差异有统计学意义(P<0.05)。结论汉黄芩素对宫颈癌Hela细胞移植瘤生长具有明显抑制作用,其作用机制可能通过抑制PI3K/AKT通路与诱导细胞凋亡有关。

白鲜皮及汉黄芩素治疗银屑病的网络药理学研究及细胞验证

【目的】通过网络药理学探讨中药白鲜皮及其主要活性成分汉黄芩素治疗银屑病靶点和机制,并进行细胞验证。【方法】通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、中医百科全书数据库检索白鲜皮化学成分,以口服生物利用度(OB)和类药性(DL)筛选其主要活性成分及作用靶点,在GeneCard数据库检索银屑病疾病靶点,对二者取交集得到白鲜皮潜在调控靶点。对这部分靶点进行基因富集分析,并使用STRING数据库、Cytoscape软件制作蛋白互作图,再进一步使用CytoHubba插件进行关键基因的筛选。选取调控关键基因最多的主要活性成分汉黄芩素进行细胞实验:制作HaCaT细胞银屑病样模型,确定汉黄芩素的半抑制浓度(IC50),以10%IC50干预银屑病样细胞模型,对关键基因进行实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测。【结果】白鲜皮共筛选出11种有效单体成分,共计对应106个有效靶点,银屑病包含4055个可供调控的靶点,取交集发现其中63个可能是白鲜皮治疗银屑病的潜在调控靶点。基因富集分析结果显示白鲜皮主要有效成分调控银屑病主要通过免疫与炎症相关通路。CytoHubba插件筛选出10个关键基因,主要受槲皮素、木犀草素、汉黄芩素调控。汉黄芩素进一步被作为研究对象,处理以1μg/mL脂多糖(LPS)诱导细胞4 h构建的HaCaT细胞银屑病样模型,汉黄芩素对HaCaT细胞的IC50为415μmol/L。以汉黄芩素10%IC50干预模型细胞,结果显示其可以显著提高PPARG mRNA表达,降低ESR1、HSP90AA1、IL-6、NF-κB、PTGS2、TNF-α、TP53 mRNA表达(P<0.005)。【结论】白鲜皮主要有效成分汉黄芩素可能通过调控TNF-α、IL-6、NF-κB、TP53、HSP90AA1、ESR1、PTGS2、PPARG mRNA表达,降低炎性水平,从而治疗银屑病。

汉黄芩素调控TLR4/MAPK/NF-κB信号通路对糖尿病肾病大鼠肾纤维化的影响

目的研究汉黄芩素对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠肾纤维化的保护作用及其作用机制。方法构建DN大鼠模型。将大鼠随机分为对照组、模型组、汉黄芩素低剂量组、汉黄芩素中剂量组、汉黄芩素高剂量组、二甲双胍组,每组各10只。除对照组外,其余各组大鼠均采用腹腔注射链脲佐菌素65 mg·kg^(-1)联合高脂高糖喂养12周的方法构建DN大鼠模型。造模完成后,各组分别连续28 d灌胃给予相应药物或生理盐水,每天1次。给药前和给药后间隔1周分别检测各组大鼠空腹血糖(FBG)含量;28 d后,称大鼠体质量,生化分析法检测24 h尿蛋白量(24 h-Pro)和血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)含量,HE染色法观察肾组织病理学改变,Masson染色法观察肾组织纤维化状况,免疫组化检测各组大鼠肾组织相关蛋白表达,Western blot法检测肾组织蛋白TLR4、MAPK、NF-κB、Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Col-Ⅲ)表达。结果与对照组相比,模型组大鼠FBG含量、24 h-Pro和血清BUN、SCr含量均明显升高(P<0.01),体质量明显降低(P<0.01);肾组织出现肌束紊乱、炎性细胞浸润、弥漫性水肿、肾小球体积增大、系膜增生,肾小管扩张,肾间质大量炎性细胞浸润等病理学改变及肾小球、肾小管间质纤维化,胶原容积分数(CVF)升高(P<0.01);TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达明显上调(P<0.01);与模型组相比,汉黄芩素各剂量组和二甲双胍组大鼠FBG含量、24 h-Pro和血清BUN、SCr含量均明显降低(P<0.01),体质量明显升高(P<0.01);肾组织纤维化明显改善,CVF明显降低(P<0.01);TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论汉黄芩素可对DN大鼠肾纤维化有明显保护作用,其作用机制可能与TLR4/MAPK/NF-κB信号通路有关。

汉黄芩素在骨关节炎中的药理作用及其机制的研究进展

骨关节炎是一种常见的关节疾病,具有不同程度的炎症和持续的氧化应激。天然黄酮类化合物汉黄芩素通过抑制软骨或者软骨细胞的氧化应激、炎症、基质降解等关键分子学效应来发挥对关节软骨的保护作用,从而延缓骨关节炎的病情进展。汉黄芩素在骨关节炎软骨细胞中诱导低水平的ROS,通过激活ROS/ERK/Nrf2/HO-1-SOD2-NQO1信号轴调节氧化还原介导的Nrf2/ARE通路,从而调节软骨细胞的代谢。氧化还原调节剂具有抗炎和软骨保护剂的潜力,汉黄芩素作为一种有希望的候选药物,具有巨大的开发利用前景,不断明确汉黄芩素对骨关节炎的多途径、多靶点的调控机制,将为开发汉黄芩素的衍生物或类似化合物提供有利的条件。

汉黄芩素对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠气道炎症的影响及机制

目的研究汉黄芩素(Wog)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠气道炎症的影响及可能机制。方法将84只大鼠按随机数字表法分为对照组,模型组,Wog低、高剂量组(灌胃给药,50、100 mg/kg),氨茶碱组(阳性对照,灌胃给药,2.3 mg/kg),重组大鼠受体相互作用蛋白激酶1[rRIPK1,受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)激活剂]组(尾静脉注射给药,8μg/kg),Wog高剂量+rRIPK1组(灌胃100 mg/kg Wog并尾静脉注射8μg/kg rRIPK1),每组12只。除对照组外,其余各组大鼠均利用烟熏联合气管注射脂多糖的方法构建COPD模型。建模24 h后,进行给药处理;每天给药1次,持续4周。末次给药后,测定各组大鼠的吸气峰流量(PIF)、呼气峰流量(PEF)、每分钟通气量(MV)和第1秒用力呼气容积(FEV_(1))/用力肺活量(FVC)比值,测定大鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,观察大鼠肺组织病理形态学变化,测定大鼠肺上皮细胞凋亡率,并测定大鼠肺组织中RIPK1、RIPK3、混合系激酶区域样蛋白(MLKL)mRNA和RIPK1、RIPK3、磷酸化MLKL(p-MLKL)蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组大鼠PIF、PEF、MV、FEV_(1)/FVC比值显著降低(P<0.05),IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.05),肺组织有大量炎症细胞浸润、支气管壁增厚,肺上皮细胞凋亡率及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA和RIPK1、RIPK3、p-MLKL蛋白表达水平也显著升高(P<0.05)。与模型组比较,Wog低、高剂量组大鼠上述指标均显著改善(P<0.05),病理损伤明显减轻;而rRIPK1组大鼠对应指标却显著恶化(P<0.05),病理损伤也进一步加重;并且,rRIPK1可明显减弱高剂量Wog对COPD大鼠气道炎症和RIPK1/RIPK3/MLKL通路的抑制作用(P<0.05)。结论Wog可能通过抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路改善COPD大鼠的气道炎症。

基于网络药理学研究汉黄芩素治疗糖尿病视网膜病变的机制

目的基于网络药理学筛选汉黄芩素治疗糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的特征靶点和分子通路,并通过细胞实验对关键靶点进行初步验证,阐述汉黄芩素治疗DR的作用机制。方法利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharma-cology Database and Analysis Platform,TCMSP)筛选出汉黄芩素的作用靶点,利用比较毒理学数据库(Comparative Toxicogenomics Database,CTD)、人类基因功能和网络分析数据库(Human Gene Function and Network Analysis Database,GenCLiP)、DisGeNET和GeneCards数据库筛选出DR的相关作用靶点,利用STRING数据库及Cytoscape 3.6.1软件构建蛋白相互作用网络(Protein-Pro-tein-Interaction-Network,PPI),利用注释可视化和集成发现数据库(Database for Annotation Visual-ization and Integrated Discovery,DAVID)对靶点进行基因本体(Gene Ontology,GO)注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路富集分析。最后通过汉黄芩素干预高浓度D-葡萄糖诱导ARPE-19细胞病变模型实验初步验证相关通路中的核心靶点,在光镜下观察细胞形态,用细胞增殖及毒性检测试剂盒(cell counting Kit-8,CCK8)检测细胞存活率,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法分析靶点基因的表达量。结果筛选出汉黄芩素的潜在靶点204个,与DR相关的靶点313个,汉黄芩素靶点与DR靶点交集后获得30个核心靶点。GO富集分析显示,汉黄芩素主要涉及渗透胁迫响应、膜筏和胰岛素受体底物结合等生物过程。KEGG靶点分析显示,糖尿病并发症的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体(advanced glycation end-advanced glycation end receptor,AGE-RAGE)、内分泌抵抗、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂抵抗和白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)等信号通路基因富集较多。最后,通过体外ARPE-19细胞实验成功验证糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路中蛋白激酶B(protein kinase B,AKT1)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma 2,BCL2)和胱天蛋白酶3(caspase-3,CASP3)是重要靶点,提示汉黄芩素对DR有显著改善作用。结论利用网络药理学揭示了汉黄芩素通过多靶点、多通路的形式治疗DR疾病,通过体外细胞实验成功验证了AGE-RAGE信号通路中的核心靶点,为进一步阐释汉黄芩素治疗DR的作用机制提供了科学依据。

汉黄芩素抗非小细胞肺癌细胞的作用研究

目的:探讨汉黄芩素对H1299与A549非小细胞肺癌细胞的作用,以期为汉黄芩素抗肺癌作用研究提供理论依据。方法:采用CCK-8法检测汉黄芩素对H1299和A549细胞活力的影响,确定汉黄芩素后续实验给药剂量;采用平板集落形成实验研究汉黄芩素对H1299和A549细胞增殖的抑制作用;细胞划痕实验考察汉黄芩素对H1299和A549细胞迁移能力的影响;流式细胞术检测汉黄芩素对H1299和A549细胞周期及凋亡的影响。结果:汉黄芩素可抑制H1299和A549细胞的生长,对H1299和A549细胞集落形成有显著抑制作用(p<0.01),表明汉黄芩素能有效抑制H1299和A549细胞的生长和增殖。汉黄芩素能够抑制H1299和A549细胞的迁移能力,且随着给药浓度和给药时间的增加,细胞的迁移率减小。流式细胞术检测发现汉黄芩素能将H1299和A549细胞周期阻滞在G0/G1期且能促进H1299和A549细胞凋亡。结论:汉黄芩素能够抑制H1299和A549细胞的生长、增殖和迁移,阻滞细胞周期在G0/G1期并可促进肺癌细胞凋亡。

基于药理学和实验验证的方式探究汉黄芩素抑制肺动脉平滑肌转化机制

目的汉黄芩素是黄芩的主要活性成分之一,具有抗炎、抗血管生成和抗纤维化的作用。然而,关于汉黄芩素对肺动脉高压(PH)的影响仍缺乏系统研究。本研究旨在通过网络药理学方法阐明汉黄芩素抗肺动脉高压的潜在机制,并进一步通过肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的生物学实验加以验证。方法通过网络药理学方法和分子对接技术预测和分析了汉黄芩素抗PH的潜在靶点和通路。随后,用血小板生长因子(PDGF)诱导PASMC增殖,检测了细胞的活力和迁移能力。采用Western印迹法分析了相关信号通路的变化。结果首先得到了40个与汉黄芩素抗PH作用相关的潜在靶点。基于PPI网络、GO和KEGG富集以及分子对接,结果表明汉黄芩素对PH的作用与PASMC的增殖和HIF-1α通路密切相关。结论汉黄芩素能有效抑制PDGF-BB介导的PASMC的增殖、迁移和表型转化。其抗增殖作用可能是通过调节HIF-1/NOX4通路实现的。