江浙蝮蛇蛇毒中抗肿瘤蛋白的分离纯化及活性研究

利用离子交换和凝胶过滤层析等分离技术从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化到一种抗肿瘤蛋 白,经SDS-聚丙酰胺凝胶电泳检测其分子量为58．2ku。MTT法测定该蛋白对K562细胞的LC50为 4．96μn/mL,电子显微镜观察其能引起K562细胞的凋亡,琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯状条 带,实验结果表明该蛋白对K562细胞有明显的抑制作用。

江浙蝮蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin的研究 Ⅰ.分离纯化和初步表征

江浙蝮蛇毒中存在有多种精氨酸酯酶,其中有多种已被纯化,本研究应用离子交换和凝胶过滤等方法,新分离纯化了一种精氨酸酯酶,命名为Agkihpin,分子量约为25·46KDa,等电点约为7·43,含235个氨基酸残基,糖蛋白染色阴性,是单链蛋白,对TAME的最适pH为8·2。

江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒神经生长因子的分离纯化和特性

神经生长因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗ ｔｈ ｆａｃｔｏｒ， Ｎ Ｇ Ｆ）是第一个被发现，也是迄今为止研究得最为清楚的一种神经营养因子 利用 Ｐ Ｃ１２ 细胞生物活力测定为跟踪检测手段，分别经过 Ｃ Ｍ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ Ｌ６ Ｂ、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５ 及 Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ ｍ ｏｎｏ Ｓ层析，从３０ ｇ 江浙蝮蛇粗毒中分离纯化到２００ μｇ Ｎ Ｇ Ｆ，纯化倍数高达１０５经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 测定，该蛋白分子量为 ２６ ｋ Ｄ，由两个亚基通过二硫键交联组成二体形式等电聚焦显示其等电点为６７，与氨基酸组成分析结果相吻合 江浙蝮蛇神经生长因子的生物活力水平与小鼠２５ Ｓ Ｎ Ｇ Ｆ相当，在１～１００ μｇ／ Ｌ 的浓度范围内维持 Ｐ Ｃ１２

江浙蝮蛇毒镇痛组分对吗啡依赖大鼠尾状核神经肽的调控作用

目的:研究江浙蝮蛇毒镇痛C4组分对大鼠尾状核中神经肽水平的调控作用。方法:应用微透析技术,探针定位于大鼠尾状体,以人工脑脊液透析,HPLC检测亮氨酸脑啡肽、β-内啡肽和P物质的含量,动态监测其变化。结果:在吗啡依赖大鼠给予C4组分后,尾状核亮氨酸脑啡肽含量显著增高,为可乐定组的1.5倍,并持续作用8h以上,而β-内啡肽和P物质含量变化较小。结论:C4组分主要作用于亮氨酸脑啡肽,通过提高其含量发挥镇痛作用。

三步柱色谱法从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化类凝血酶

建立了一种用CM Sepharo se CL-6B阳离子交换、DEAE Sepharo se Fast F low阴离子交换和Sephadex G-75凝胶排阻三步柱色谱从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法。在实验室小柱分离方案的基础上,对该纯化工艺进行了放大。当上样量达实验室小柱的25倍时,所得类凝血酶的质量指标与实验室小柱基本一致。采用该法所得的蝮蛇类凝血酶经Sh im-pack D io l-300高效凝胶排阻柱测得其相对分子质量约为33 500,用Sh im-pack VP-OD S反相色谱柱检测其纯度约为96%。从江浙粗蛇毒中提取类凝血酶时,类凝血酶的总质量收率约为0.3%,总活性收率约为64%,比活可达2 000U/m g。

精制抗江浙蝮蛇毒血清与韩国三种蝮蛇毒的交叉中和作用

目的 考察本所精制抗江浙蝮蛇毒血清能否中和三种韩国蝮蛇毒及其中和能力。方法 用免疫双扩散法鉴定抗江浙蝮蛇毒血清与三种韩国蝮蛇毒交叉反应。并根据动物实验结果计算出每毫升抗血清中和三种韩国蝮蛇毒的致死毒及出血毒的量。结果 中国精制抗江浙蝮蛇毒血清 1.0ml可分别中和韩国黑眉蝮蛇毒、短尾蛇毒和乌苏里蝮蛇毒液态原毒的致死毒 1、3.9和 2 .5mg ;同时可分别中和上述 3种蛇毒蛋白 0 .8、3.15和 2 0mg中和出血毒。结论 中国精制抗江浙蝮蛇毒血清具有中和上述三种韩国蝮科蛇毒的作用。

江浙蝮蛇毒C_4组分的分离纯化及药理性质研究

目的:分离筛选江浙蝮蛇毒的C4组分,研究其毒性、机体耐受性和依赖性等药理学性质。方法:采用离子交换和分子筛,以柱层析法分离蛇毒C4组分,并用急性毒性实验和自然戒断实验、耐受性实验考察其毒性、依赖性和耐受性。结果:经分离筛选后得到C4组分,并获得蛇毒C4组分的毒性作用、机体耐受性和依赖性等性质。结论:C4组分作为江浙蝮毒中的一个有效组分,在一定剂量范围内安全性良好,未发现耐受性和依赖性,值得进一步开发利用。

江浙蝮蛇毒镇痛组分的中枢作用机制研究

目的 探讨江浙蝮蛇毒镇痛C4组分的可能作用途径。方法 通过C4组分与阿托品、利血平、纳络酮药物的相互作用 ,探索其与乙酰胆碱受体、囊泡递质、阿片受体间可能的作用 ;通过脊髓化鼠实验、侧脑室给药和足跖定压实验揭示其中枢性作用 ;通过不同脑区的组织匀浆测定神经肽含量 ,考察C4组分对不同中枢部位的作用大小。结果 C4组分不通过乙酰胆碱受体作用 ,而与阿片受体相关 ,它通过中枢起效 ,主要作用部位集中在丘脑、尾状核和红核等 ,对亮氨酸脑啡肽的含量有刺激增高作用。

江浙蝮蛇毒中性磷脂酶A_2的免疫学研究

用江浙蝮蛇毒中纯化的中性磷脂酶A2（NPL2）免疫家兔，获得了多克隆抗体.抗体与抗原结合后，抑制了该抗原的神经毒性，而对其催化活力无影响，表明NPLA2有两个活性结构域，即神经毒性与催化活性分别位于两个活性位点上。利用免疫亲和层析纯化了NPLA2的多抗，经ELISA检测，与酸性PLA2和碱性PLA2均有免疫交叉反应，这提示了NPLA2与酸性PLA2及碱性PLA2的抗原决定簇有同源性。

江浙蝮蛇毒溶血毒素晶体培养及初步晶体学研究

从江浙蝮蛇中分离纯化的碱性磷脂酶Ａ２在ｐＨ９．５，０．０５ｍｍｏｌ／ＬＣＨＥＳ缓冲液中，用汽相悬滴扩散的方法，获得了适用于高分辨率Ｘ射线结构分析的单晶．经Ｘ２００Ｂ面探测器分析，表明该晶体属于正交晶系，Ｐ２Ｉ２Ｉ２Ｉ空间群，晶胞参数为ａ＝９７．１３，ｂ＝１０３．６９，ｃ＝２３．２７．并收集了一套衍射数据，独立衍射点数１２００１个，数据完整度为８６．２％，Ｒｍｅｒｇｅ为０．０４５９．最高分辨率达２．０，根据分子量与晶胞体积估算，一个不对称单位含两个分子．

江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒的抑菌作用及其抑菌组分L-氨基酸氧化酶的分离纯化

我们用平皿测活法研究了江浙蝮蛇毒对真菌和大肠杆菌生长的抑制作用,并对其抗细菌的组分进行柱层析分离纯化,得到组分单一的LAO:不仅有抑菌作用还有L-氨基酸氧化酶的活性。纯化后LAO的比活力为808U/mg。蛇毒经酸性聚丙烯酰胺电泳后测抑菌活性发现有3个抑菌组分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),LAO为抑菌组分Ⅱ。

江浙蝮蛇毒C_4组分的中枢镇痛作用及其机理研究

目的:研究江浙蝮蛇毒镇痛C4组分的中枢镇痛作用并初步探讨其镇痛机理。方法:通过侧脑室给药、脊髓化鼠镇痛实验和足跖定压刺激试验研究C4组分的镇痛作用部位;通过C4组分与阿托品、利血平、纳络酮药物的相互作用,研究其与乙酰胆碱受体、阿片受体间的作用关系。结果:C4组分的镇痛部位主要在脑中枢,且C4组分不通过乙酰胆碱受体作用,而与阿片受体相关。结论:江浙蝮蛇毒C4组分镇痛通过中枢起效,提示江浙蝮蛇毒C4组分可能与增加内源性阿片肽系统的活动有关。

江浙蝮蛇蛇毒纤溶酶的纯化

目的 从江浙蝮蛇蛇毒中纯化出无出血毒的纤溶酶。 方法 经 DEAE-Sepharose FF离子交换树脂和 Superdex 75 PG凝胶过滤树脂 ,从江浙蝮蛇蛇毒中纯化出 2种可直接溶解纤维蛋白的蛋白酶 :F1 ,F2。 结果 它们 2 0 μg皮下注射小鼠都无出血反应 ,F1 ,F2 SDS-PAGE电泳纯度在 95 %以上。 结论 纯化的两个纤溶酶为进一步基础研究和临床应用奠定了基础。

江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因的克隆及测序

从江浙蝮蛇毒腺中抽提总RNA,RT—PCR进行体外扩增,获得江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因,克隆至pGEX-5X-3载体中.对3个重组克隆分别作DNA全序列分析.通过遗传密码推导出相应的氨基酸序列.与其它已知的丝氧酸蛋白酶型蛇毒蛋白的氨基酸作比较,其中许多位置上氨基酸有很强的同源性.该基因的成功克隆,不仅推导出江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子的蛋白质序列,也为进一步开展江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子蛋白质工程的研究工作打下良好的基础.

江浙蝮蛇毒镇痛组分的分离纯化及其理化性质

目的 分离筛选江浙蝮蛇毒中主要镇痛组分 ,研究其分子量、等电点、纯度、氨基酸序列、稳定性等理化性质 ,以及镇痛作用、机体耐受性和依赖性等药理学性质。方法 采用离子交换和分子筛 ,以柱层析法分离蛇毒组分。用生化测定方法 ,测定其理化性质。用热板法和醋酸扭体法等确定最佳镇痛组分 ,并用纳洛酮催促和自然戒断实验、耐受性实验考察其依赖性和耐受性。结果 分离获得 14个蛋白组分 ,经ED50 /LD50 筛选出最佳镇痛组分C4 ,鉴定结果表明纯度为电泳纯 ,HPLC相对纯度为 92 .16 % ,分子量 16 .6ku ,等电点 8.8,氨基酸序列与磷脂酶A2 同源 ,为一种新的镇痛蛋白 ,并获得其紫外吸收特征峰、镇痛耐受和依赖性等性质。结论 C4组分具有显著的镇痛效果 ,未发现耐受性和依赖性 ,值得进一步研究开发。

江浙蝮蛇蛇毒蛋白诱导K562细胞调亡的研究(英文)

目的 :研究江浙蝮蛇蛇毒蛋白诱导K5 6 2细胞调亡。方法 :通过电镜观察蛇毒蛋白作用后K5 6 2细胞的形态变化 ;MTT检测蛇毒蛋白对细胞增值的影响 ,同时应用流式细胞仪检测细胞凋亡数及其对细胞周期的影响 ;采用琼脂糖凝胶电泳观测凋亡片断。结果 :蛇毒蛋白作用K5 6 2细胞后 ,能显著抑制细胞增值 ;LC5 0为4 .96 μg/mL ,电镜可观察到凋亡形态学改变 ;电泳呈现典型的阶梯状条带 ,流式细胞仪检测到凋亡峰。 结论 :江浙蝮蛇蛇毒蛋白可诱导K5 6 2细胞调亡。

江浙蝮蛇蛇毒中神经生长因子的分离新方法探讨

为从江浙蝮蛇蛇毒中分离出神经生长因子,采用 CM-Sepharose FF 及 Sephacryl S-200柱层析方法进行了分离纯化,从中分离出一种组分。该组分经鸡胚背根神经体外培养证明具有促进神经节神经纤维生长的活性,证实为神经生长因子。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为一条区带,其分子量约为27000,该试验结果表明用此种方法从江浙蝮蛇中提取神经生长因子是简便可行的。

正交晶型江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2初步结晶学研究

The basic phospholipase A2 from the venom of Agkistrodon halys pallas possesses the ability to cause hemolysis in contrast to the other two phospholipase A2 from the same venom. A new form of crystals of this enzyme was grown. The crystals belong to space group of P212121 with unit cell parameters of a=9. 175nm, b=10.080nm , c=2.287nm.The crystals diffract to high resolution, and are suitable for detailed structural studies. The data were collected up to 0.25nm resolutiorl using synchrotron radiation-imaging plate-Weissenberg camera system. Preliminary analysis reveals the presence of two molecules in the asymmetric uint and the molecule may pack with the smallest dimension approximately parallel to the c axis. The new crystal form is more attractive than the monoclinic one previously reported for crystallographic structure determination as it contains fewermolecules in the asymmetric unit.

江浙蝮蛇毒出血毒、致死毒及抗毒素标准品的建立

【摘 要】目的 以日本标准品标化我所制备的江浙蝮蛇毒标准品出血毒、致死毒及抗毒素的单位及效价。方法 经动物试验，通过统计学方法统计计算各项结果。结果 我所制备的标准品出血毒为180TD/AMP，致死毒为450TD/AMP，抗出血毒效价为6250IU/AMP，抗致死毒效价为3600U/AMP。结论 所制备的标准品可用于江浙蝮蛇毒出血毒、致死毒及抗毒素效价的检测。