DNA池结合DHPLC和直接测序技术在江豚SNPs检测中的应用

选取江豚基因组中的2个已知单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位点，通过PCR扩增，将PCR产物按基因频率不同制备成0～50％的11个DNA池（DNAp001），用于变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）和直接测序分析，以探讨DNA池中基因频率的最低要求。结果显示，当稀有等位基因的基因频率不少于5％时可在DHPLC检测过程中明显分辨；而利用DNA池进行直接测序时的基因频率则需达到10％。这提示，为保证DHPLC分析的准确性和可靠性，制备DNA池时等摩尔DNA混合的个体数最好不超过10个。DNA池结合DHPLC技术的高效性与准确性可在大规模的SNPs位点筛选中发挥作用。

利用DNA池和测序技术快速筛查SNPs及估算基因频率

选取产蛋性能具有明显差异的 4个鸡品种(莱航鸡、阳山鸡、丝羽乌骨鸡和隐性白洛克鸡 )构建品种DNA池,采用测序的方法研究鸡催乳素基因 5′侧翼调控区远端序列 (1 028bp)的多态性,快速筛查到 8个可能与产蛋性能相关的SNPs(C 2402T、T 2192C、C 2161G、C 2134G、C 2062G、G 2040A、A 1944G和C 1884A)。进一步利用测序图中SNP等位基因峰高的比值估算各鸡品种等位基因的频率,其中C 2402T、C 2161G、C 1884A和C 2062G、G 2040A位点等位基因频率的估算结果分别被PCR RFLP、PCR SSCP所验证,说明测序峰高比值估算等位基因频率的方法具有一定的可行性。

基于DNA池测序法筛选奶牛高信息量SNP标记的可行性

首先选择139个牛SNP标记,利用DNA池测序法,根据测序峰图中不同碱基信号峰高的比值确定了92个SNP为高信息量标记(比值>1/2);为了进一步验证筛选的准确性,对其中59个标记采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术检测了122头荷斯坦牛的基因型。结果显示,检出率高于85%的标记有56个,其平均最小等位基因频率(Minor allele frequency,MAF)为0.41,最小值为0.27,最大值为0.5;MAF>0.3的标记有54个,占96.4%(54/56)。文章结果表明,采用DNA池测序法筛选高信息量SNP标记是可行和可信的。

猪DAZ基因的DNA池测序分析

选取大约克猪、白香猪、可乐猪3个猪种的公猪构建品种DNA池。对DAZ基因的部分CDS区和3′UTR进行PCR扩增,并对PCR产物进行测序。结果表明,3个猪种中,DAZ基因的该序列未发现任何突变。同源性分析结果表明,猪与人、猩猩、猴、鼠、牛的DAZ基因该序列核苷酸同源性分别为97.0%、95.2%、96.1%、92.9%、97.0%。说明在哺乳动物中,其DAZ基因CDS部分序列和3′UTR是高度保守的。系统进化分析结果表明,猪和牛在一个进化支上。蛋白疏水性分析表明,在17-20位有个强疏水区。

基于基因组DNA混合池的EST-SSR引物快速筛选方法研究

林木SSR标记的引物筛选工作量大,十分费时且消耗大量实验材料。采用基因组DNA混合池技术,将研究对象的若干个基因组DNA样品等量混合后,作为单一模板进行SSR的PCR扩增,能显著降低实验的工作量和成本。以选择的150对EST-SSR引物为对象,对6个桉树基因组DNA样品进行等量混合,进行PCR扩增筛选引物,结果表明,与常规筛选方法相比,基因组DNA混合池方法大幅度缩短了实验周期,显著减少了基因组DNA的消耗,可用于大量林木SSR引物的快速高效筛选。

利用DNA池对3个山羊品种CXCL10基因多态性的研究

为了研究3个山羊品种(黔北麻羊、内蒙古绒山羊、关东奶山羊)CXCL10基因多态性,试验采用构建DNA池并直接对其测序的方法进行分析。结果表明:快速筛查到2个与繁殖性能相关的单核苷酸多态性(T-131-C,G-661-A)。进一步利用测序图中的SNP等位基因峰高的比值估算各山羊品种等位基因的频率。

水貂GHR基因的DNA池测序分析

为了研究水貂资源群体中GHR基因的单核苷酸多态性(SNPs),试验选取明华黑色水貂、银蓝色水貂的公貂构建品种DNA池,对GHR基因的第10外显子进行PCR扩增并测序。结果表明:试验发现两处SNPs突变,分别为209位点(T/C)、533位点(C/A)。

样本数量和终质量浓度对DNA混合池PCR扩增质量和测序效果的影响

为筛选适宜的DNA混合池法,采用两因素交叉分组设计,以混合样本数量(20、60和150个)和终质量浓度(50、100和150ng/μL)为组合因子,分析不同混合池对PCR扩增质量及SNPs检出率的影响。结果表明:在同一混合样本数量下,以终质量浓度100ng/μL建立的DNA混合池扩增的PCR产物纯度和OD260/OD280均优于50ng/μL,但对测序结果无显著影响;以终质量浓度150ng/μL建立的DNA混合池扩增的PCR产物杂带较多,不符合测序要求。在同一混合样本终质量浓度下,混合样本数越多,SNPs检出率越高。综上,从PCR扩增质量、SNPs检出率和试验成本来分析,以混合样本150个、终质量浓度100ng/μL组合建立的DNA混合池效果最好。

利用DNA池和变性高效液相色谱分析bcr和abl基因序列标签位点多态性

为了探讨bcr和abl基因的单核苷酸多态性(SNP)与慢性髓细胞性白血病(CML)的关系,利用DNA池(DNApooling)结合变性高效液相色谱(dHPLC)技术对bcr和abl基因上的9个序列标签位点(sequencetaggedsite,STS)进行序列变异的筛查分析,并通过测序对筛查结果进行验证。研究结果表明,在9个STS片段中检出了4个片段中的多态性位点和3个片段中与参考序列不一致的变异。结论:U07000片段中的SNP在慢性髓性细胞白血病病人和对照人群中的基因频率分布有显著差异。

混合DNA样品池扩增法及其应用

将个体 DNA提取出来后 ,按一定方式进行混合 ,构成混合 DNA样品池。这种混合 DNA样品可用于病因未明的遗传性及遗传易感性疾病的研究。在研究常染色体隐性遗传性耳聋致病基因时 ,发现与染色体 9q的 D9S92 2和 D9S30 1位点有相关性。此方法比通常的连锁分析法省时省力。在肿瘤相关基因或责任基因的研究、法医学的个体认定、基因突变的检测等方面均显示出实用性 。

DNA混合池技术及其在精神分裂症遗传研究中的应用

DNA混合池技术近年来在国际上逐渐被广泛应用于各种遗传性疾病的研究,尤其是对复杂性遗传病的大样本全基因扫描关联分析。这种方法可以大大减少工作量,降低研究成本,缩短研究周期。本文综述了DNA混合池(DNA pooling)技术的原理、实验方法、统计学处理以及在精神分裂症遗传研究中的应用。

DNA池快速筛查奶牛TLR_2基因多态性及等位基因频率估算

为了探讨Toll样受体2基因多态性,本试验选取中国荷斯坦牛为试验对象构建DNA池,并结合直接测序法对TLR_2基因编码区进行多态性筛查。结果显示,快速筛查到6个核苷酸位点,分别为T^(602)A、G^(10900)C、G^(11047)C、A^(11076)T、C^(12077)T、T^(10634)G,其中T^(10634)G为错义突变,氨基酸由原来的谷氨酸(Gly)转变为天冬氨酸(Asp),SNPs突变前后等位基因频率有明显差异。研究结果可为中国荷斯坦牛的分子遗传育种提供理论依据。

混合DNA样品池应用的研究

将个体ＤＮＡ提取出来后，按一定方式进行混合，构成混合ＤＮＡ样品池。这种混合ＤＮＡ样品可用于病因未明的遗传性及遗传倾向十分明显疾病的研究。此方法比通常的连锁分析省时、省力。在肿瘤相关基因或责任基因的研究中以混合ＤＮＡ样品用比较基因组杂交（ＣＧＨ）法对一些研究的结果也显示了它的实用性。另外，混合ＤＮＡ样品也可用在法医学的个体认定、基因突变的检测及短串联重复序列的鉴定。是一个值得研究和推广的方法。

利用DNA池技术提高基于InDel标记的种子纯度鉴定效率

为提高基于InDel-Pyrosequencing的黄瓜杂交种纯度检测通量,降低检测成本,本研究模拟10种DNA Pooling进行PCR、Pyrosequencing及等位基因频率分析。通过TTest分析不同Pooling间等位基因频率的差异性,确定3 Pooling为种子纯度检测最适Pooling数;建立3 Pooling-InDel-Pyrosequencing标准曲线,其R2达0.999 1;根据该标准曲线,检测黄瓜杂交品种"园中王"30粒杂交种种子纯度,结果为96.67%。本研究丰富了基于InDel-Pyrosequencing的黄瓜杂交种纯度检测技术体系。

双链置换探针实时PCR用于DNA池的等位基因频率测定

结合荧光双链置换探针的特异性和实时PCR的准确定量能力,建立了一种新颖、准确、价廉且高通量的测定DNA池等位基因频率的方法.该方法采用不同荧光标记的双链置换探针1次PCR反应即可测定出等位基因频率.实验以β 地中海贫血CDs41 42( TCTT)突变为对象,分别用荧光染料FAM和ROX标记野生型和突变型探针,由实时PCR检测建立的等位基因浓度与循环阈值的响应曲线计算DNA池的等位基因频率.结果表明,建立的系列等位基因浓度与循环阈值呈线性关系,线性相关系数分别为0.9977(野生型等位基因)和0.9938(突变型等位基因),可检测的最低等位基因频率达1%,等位基因频率在1%～90%范围内测定误差小于4%.该方法可广泛用于流行病学调查、遗传连锁分析以及全基因组连锁不平衡扫描等领域.

DNA池快速筛查牛SOCS2、SOCS3和CIS基因SNPs

选取务川黑牛为试验对象构建DNA池筛查SOCS2、SOCS3和CIS基因SNPs,结果首次在牛中发现CIS基因SNPs位点。在SOCS2基因中快速筛查到的3个SNPs均位于第4外显子内,其中G3456A(Glu→Lys)和G3810A(Val→Ile)为错义突变,T3599C为同义突变;在CIS基因中发现5个SNPs,其中A4086G(Val→Met)为错义突变,位于第3外显子处,其余4个SNPs(C4410T、G4560A、C4566T和G5251C)均位于3'-UTR序列。

水貂DAZL基因的DNA池测序分析

选取短毛黑、银兰、红眼白水貂构建品种DNA池。扩增DAZL基因部分序列,对扩增产物测序。从测序结果分析可以看出,不同品种水貂间的DAZL基因部分序列完全一致;同源性表明,水貂与雪貂同源性很高(94.2%),与猪、犀牛、骆驼、江豚同源性较高(80.8%～81.8%),与牛的同源性较低(77.4%)。系统进化树显示,水貂与雪貂属同一分支。

羊RBP4基因DNA池测序分析

选择黔北麻羊、内蒙古白绒山羊、关中奶山羊3个山羊品种构建品种DNA池。对RBP4基因部分CDS区和3’UTR进行PCR产物扩增,并采用直接测序法进行测序。结果表明:所选山羊品种RBP4基因分CDS区和3’UTR区,无突变位点存在。序列分析表明,山羊与其他物种RBP4基因的同源性很高,其中以牛最高,达到98.8%。系统进化分析表明,羊和牛在同一进化支上。生物信息分析表明:RBP4基因所表达蛋白氨基酸序列中有5个磷酸化位点。因此,山羊RBP4基因在进化过程中是高度保守的。研究结果可为进一步分析山羊RBP4基因功能遗传变异提供借鉴。

羊RBP4基因DNA池测序分析

选择黔北麻羊、内蒙古白绒山羊、关中奶山羊3个山羊品种构建品种DNA池。对RBP4基因部分CDS区和3’UTR进行PCR产物扩增，并采用直接测序法进行测序。结果表明：扩增到的山羊RBP4基因序列没有发生突变位点；与其他物种RBP4基因的同源性很高，其中以牛最高，达到98．8％；说明其CDS部分序列和3’UTR是高度保守的。系统进化分析表明，羊和牛在一进化支上。生物信息分析表明：RBP4基因蛋白氨基酸序列中有5个磷酸化位点。

DNA甲基化与广西巴马地区长寿的相关性

目的探讨DNA甲基化与巴马长寿的关系。方法在广西巴马县长寿家族中选取60例90~110岁老人组成长寿组,在非长寿家族中选取48~85岁的健康者60例组成对照组。抽取外周血2 ml,构建DNA混合池,利用Roche-Nimble Gen甲基化芯片技术对研究人群的全基因组进行扫描,使用SPSS17.0软件及在线分子功能注释系统(MAS)进行数据分析,P<0.01视为甲基化程度较高的序列。结果共筛查出6 441个超甲基化位点,其中长寿组392个,对照组6 049个。高甲基化位点共涉及1 618个基因,长寿组有133个,对照组有1 485个。两组人群的高甲基化基因均涉及24个生物学功能,均以细胞过程、生理过程、生物调控为主。长寿组高甲基化基因涉及42个信号通路,对照组涉及156个信号通路。长寿组和对照组中均有与年龄相关性疾病有关联的高甲基化基因,长寿组中涉及较多疾病的基因有CCKBR、COL18A1、EGR3、H19、IL11、TIMP1、S100A1等;对照组中涉及较多疾病的基因有ACSL1、ADAMTS13、ADCY8、AHRR、ARVCF、ATP2A1、ATP5I、BCS1L、GCK、ITGA2B等。结论本研究利用芯片技术筛查获得了与长寿呈正相关和负相关的高甲基化位点、基因及其生物学功能分类、信号通路,为DNA甲基化和长寿的深入研究提供了基础数据。