气-液界面染毒系统中不同暴露流量对汽油发动机尾气致肺细胞氧化应激相关蛋白表达的影响

目的采用气-液界面(air-liquid interface,ALI)培养和暴露系统,探索二轮摩托车来源的汽油发动机尾气(gasoline engine exhaust,GEE)对人肺细胞氧化应激相关蛋白表达的影响。方法实验分为空白对照组、洁净空气组、GEE组。除了空白对照组,其余各组采用气-液界面体外染毒技术,分别在暴露流量为10、15和25 mL/min,37℃水浴条件下,对生长在气-液界面插件多孔膜上的人支气管上皮细胞BEAS-2B和人肺癌A549细胞持续暴露60 min。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法评价细胞相对存活率。采用2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-dichloro-dihydro-fluoresceindiacetate,DCFH-DA)探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测GEE对BEAS-2B和A549细胞凋亡及坏死率的影响。蛋白质免疫印迹法检测全细胞裂解物中核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)和血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达水平。结果在10、15和25 mL/min三种暴露流量下,随着暴露流量增大,GEE暴露组的2种细胞相对存活率逐渐降低、胞内ROS生成量和细胞凋亡率逐渐升高,且与洁净空气组相比,存在统计学上的显著性差异(P<0.05)。BEAS-2B和A549细胞相对存活率、胞内活性氧水平、早期凋亡率、晚期凋亡及坏死率和总凋亡率在GEE暴露和暴露流量上存在主效应,且GEE暴露与暴露流量存在交互效应(P<0.01)。在GEE暴露组,BEAS-2B细胞Nrf2和HO-1蛋白表达下降,A549细胞Nrf2和HO-1蛋白表达水平升高。BEAS-2B细胞Nrf2蛋白表达仅在暴露流量主效应上差异有统计学意义(P<0.01)。BEAS-2B细胞HO-1蛋白表达仅在GEE主效应上差异有统计学意义(P<0.01)。A549细胞Nrf2蛋白表达在GEE主效应、暴露流量主效应和交互效应上差异均有统计学意义(P<0.05)。A549细胞HO-1蛋白表达则在GEE主效应、暴露流量主效应和交互效应上差异均无统计学意义(P>0.05)。结论GEE对肺细胞具有较强的急性毒性作用;GEE诱导的细胞存活率、胞内活性氧生成和细胞凋亡率的改变受暴露流量的显著影响。暴露流量对GEE诱导的BEAS-2B和A549细胞Nrf2蛋白表达的影响显著,而对HO-1蛋白表达影响不显著。

人肺癌A549细胞气-液界面暴露汽油发动机尾气中NO2的基准剂量评估

目的通过气-液界面技术将人肺癌A549细胞暴露于不同工况下汽油发动机尾气,探讨汽油发动机尾气中的NO_2浓度与A549细胞存活率的剂量-效应关系及其基准剂量,为汽车尾气中NO_2的毒性效应风险评估提供基础数据。方法用气袋分别收集在怠速(冷启动)、53%和100%负荷下产生的汽油发动机尾气。采用盐酸萘乙二胺分光光度法检测汽油发动机尾气中NO_2的浓度;应用气-液界面技术将人肺癌A549细胞暴露于汽油发动机尾气,使用噻唑蓝比色法试剂盒检测A549细胞的相对存活率。洁净空气暴露组设为对照组,根据汽油发动机尾气中的NO_2浓度分为3个剂量组,进行剂量-效应关系分析。使用美国环境保护总署(EPA)的基准剂量工具软件(Benchmark Dose software,BMDS)中的Hill、Linear、Polynomial和Power 4种模型,根据模型拟合的AIC系数(Akaike Information Coefficient)和P值确定模型的拟合效果来计算汽油发动机尾气中NO_2的毒作用基准剂量和基准剂量下限值。结果洁净空气暴露组的NO_2浓度为0 mg/m3,A549细胞的相对存活率为90.58%±5.11%。在怠速(冷启动)、100%和53%负荷下,汽油发动机尾气中NO_2的平均浓度分别为6.6、8.2和9.2 mg/m3,A549细胞的相对存活率分别为74.27%±4.05%、63.86%±2.58%和58.77%±0.81%。Hill、Linear、Polynomial和Power 4种模型显示,随着汽油发动机尾气中NO_2浓度的升高,A549细胞的相对存活率随之降低。以拟合效果最好的Power模型估算得到的不同工况下汽油发动机尾气中NO_2的毒作用基准剂量和基准剂量下限值分别为2.83和1.96 mg/m^3。结论不同工况下汽油发动机尾气中的NO_2可对A549细胞的相对存活率产生影响,引起细胞存活率下降,并有剂量-效应关系。气-液界面暴露于汽油发动机尾气NO_2的A549细胞存活率明显降低的参考剂量为1.96 mg/m^3。