免疫共沉淀联合质谱技术筛选蓝舌病病毒NS4蛋白的互作蛋白

[目的]筛选蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)NS4蛋白颉颃干扰素(interferon, IFN)信号通路的内源性互作蛋白,以便进一步研究NS4抑制IFN信号转导的作用机制。[方法]在前期仙台病毒(Sendai virus, SeV)诱导IFN信号通路基因表达研究基础上,利用免疫共沉淀方法从转染NS4融合eGFP标签表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP和pcDNA3.1-eGFP空载体的HEK-293T细胞中钓取NS4互作蛋白,对免疫沉淀物进行SDS-PAGE分析,免疫共沉淀洗脱液进行质谱鉴定及生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白的编码基因表达特征。[结果]通过免疫共沉淀及质谱鉴定分析和数据库比对,共获得189个差异表达蛋白。生物信息学分析结果显示,候选蛋白主要参与蛋白转录、翻译、病毒感染及免疫调控。亚细胞定位分析结果显示,差异表达蛋白主要定位于细胞核、细胞质以及胞质-胞核,筛选出4个与BTV NS4蛋白存在互作的候选蛋白:多聚嘧啶束结合蛋白1(PTBP1)、细胞周期依赖性蛋白激酶9(CDK9)、N-端豆蔻酰化酶1(NMT1)和Y盒结合蛋白1(YBX1)。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,SeV刺激72 h后,试验组PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9基因mRNA表达量均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01)。[结论]BTV NS4蛋白颉颃IFN信号通路与PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9蛋白表达上调有关,本试验结果为进一步研究BTV NS4蛋白颉颃宿主天然免疫应答的分子机制提供靶标参考。

基于蛋白质沉淀的药物靶点筛选方法的研究进展

药物靶点是体内与药物分子结合的生物大分子。因此药物靶点的系统鉴定对于充分认识药物作用机制、疗效以及可能的副作用至关重要;同时全面的靶点识别可以加速药物发现及候选药物筛选的进程。生物质谱具有采集速度快、分辨率和灵敏度高等特点,是蛋白质组深度鉴定和准确定量的关键工具;基于质谱的蛋白质组学技术有助于系统性鉴定与小分子药物结合的蛋白质,阐述蛋白质-药物相互作用,在药物靶点筛选领域大显身手。常用的先进行标记再结合亲和富集的药物靶点表征方法需要对药物分子化学衍生,这既耗时也可能会改变药物的亲和力,同时衍生基团产生的空间效应可能会阻断药物和靶点相互作用,加大了靶点鉴定的难度。因此,无需衍生的药物靶点鉴定方法受到广泛关注。蛋白质受到温度、pH、变性剂以及机械力等条件的影响会发生变性、展开和沉淀。小分子药物与蛋白质结合可能改变蛋白质折叠平衡,稳定靶蛋白的构象,与游离蛋白相比,更能抵抗不同条件诱导的蛋白质沉淀。基于以上原理,联合蛋白质组学和生物质谱技术,目前已经发展了多种基于蛋白质沉淀的药物靶点规模化鉴定方法,包括热蛋白质组分析方法、溶剂诱导蛋白质沉淀方法、机械应力诱导蛋白质沉淀方法、pH依赖性蛋白质沉淀方法等,用于蛋白质组范围内的药物靶点筛选。本综述介绍了该领域近十年报道的药物靶点发现和药物-蛋白质相互作用研究方法,总结了这些方法的特点及其在药物疗效评价、药物发现等方面的发展前景。

基于蛋白沉淀光谱分析的核桃涩味评价技术研究

【目的】建立核桃内种皮涩味综合评价体系,为鲜食核桃品种选育提供理论依据。【方法】选用涩味差异明显的6个核桃品种(系),通过感官评价、内种皮水浸法和蛋白质化学沉淀法相结合的评价方式,初步建立核桃内种皮涩味综合评价技术体系。【结果】6个品种(系)的直接口感涩味值为5.83~9.27,分为差异显著的3类。水浸出物浓度为10 mg/mL时,依据水浸出物涩味值‘汾核4号’和‘ND-2’为一类,其余4个品种(系)各为一类。内种皮提取液浓度为20μl/mL时,蛋白沉淀在222 nm波长下吸光值差异最大,可将6个品种(系)分为差异显著的4类。内种皮化学沉淀吸光值与直接口感涩味值的相关系数为0.96,内种皮化学沉淀吸光值与10 mg/mL内种皮水浸出物涩味值相关系数为0.97,均呈极显著正相关。【结论】核桃内种皮提取液浓度为20μl/mL,222 nm波长条件下,通过蛋白质沉淀全光谱扫描,结合感官评价,可对核桃内种皮涩味进行有效评价。

直接蛋白沉淀结合串联质谱法用于血浆中5-氟尿嘧啶治疗药物监测应用

本文建立一种直接蛋白沉淀结合串联质谱法测定血浆中5-氟尿嘧啶浓度的方法.以0.1 mol·L^(-1)硫酸锌作为蛋白沉淀剂处理血浆样品,离心后取上清液直接测定.以5-氟尿嘧啶-^(13)C,^(15)N_(2)为内标标准品,采用Shimadzu Shim-pack GIST-HP C18-AQ (100 mm×2.1mm I.D.,1.9μm)色谱柱;水(A相)-甲醇(B相)为流动相,梯度洗脱:0—1 min,5%B;1—2 min,5%B→95%B;2—2.5 min,95%B;2.5—2.6 min,95%B→5%B;2.6—5 min,5%B,流速:0.3mL·min-1;柱温:35℃;进样体积:5μL;采用电喷雾离子源,负离子多反应监测模式(MRM)进行质谱定量分析.检测离子对:5-氟尿嘧啶m/z 129.1→42.1,5-氟尿嘧啶-^(13)C,^(15)N_(2)内标标准品m/z 132.1→44.1.该方法校准曲线相关系数大于0.999.质控品测定准确度结果与理论值接近,批内及批间准确度在94.8%—99.0%之间,RSD在0.9%—4.8%之间.5-氟尿嘧啶提取回收率在95.6%—99.8%之间.基质因子在0.92—0.96之间,内标归一化的基质因子在0.99—1.00之间.稳定性各实验条件下每一测定浓度的均值与标示浓度的相对偏差RE均在-5.2%—1.7%之间.该方法前处理简便、分析速度快、灵敏度高、专属性强、稳定性好,可用于5-氟尿嘧啶治疗药物监测.

Co-IP联合质谱分析筛选中华蜜蜂气味受体OR1和OR2的互作蛋白

【目的】中华蜜蜂(Apis cerana cerana)是我国特有的蜜蜂品种,其高度灵敏的嗅觉系统能在复杂气味环境中识别群体内化学信号以及区分食物源散发的特异性气味分子,气味受体(Odorant receptors,ORs)在中蜂识别气味分子的行为过程中起到了重要而又关键的作用。通过分析筛选OR1和OR2的互作蛋白,为深入探究OR1和OR2蛋白在蜜蜂嗅觉系统中的功能提供理论依据。【方法】通过构建OR1和OR2基因的真核表达载体pFastBac-OR1和pFastBac-OR2载体,转染Sf9细胞,提取细胞总蛋白,利用免疫共沉淀(Co-IP)联合质谱分析技术筛选鉴定与OR1和OR2互作的细胞蛋白,并对这些互作蛋白进行GO功能注释、KEGG信号通路和蛋白互作网络分析。【结果】IP组和IgG组重组蛋白在细胞内得到正确表达,利用Co-IP联合质谱分析技术共筛选到273个与OR1互作的细胞蛋白和204个与OR2互作的细胞蛋白,主要为微管蛋白、热休克蛋白、核糖体蛋白等。对这些蛋白进行GO功能富积分析,发现这些蛋白质涉及多种生物学功能,包括RNA剪接、核糖体和能量运输有关。KEGG信号通路分析结果表明互作蛋白参与调节了多条细胞内的重要通路,包括核糖体、剪接体、RNA转运等与核糖体相关的通路,丙酮酸代谢、硫胺素新陈代谢、脂肪酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、FoxO信号通路,Hedgehog信号通路等。【结论】OR1和OR2可能通过与多种蛋白直接或间接的相互作用调控并影响其嗅觉感受。

罗非鱼-大豆共沉淀蛋白乳液稳定二十二碳六烯酸藻油的研究

为探究共沉淀蛋白乳液稳定二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid,DHA)藻油的可行性,该研究以罗非鱼分离蛋白(tilapia protein isolate,TPI)、3种罗非鱼-大豆共沉淀蛋白(tilapia-soy protein co-precipitates,TSPC_(2∶1)、TSPC_(1∶1)和TSPC_(1∶2))和大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)为乳化剂,高压均质制备TPI、TSPC和SPI-DHA藻油乳液,比较5种乳液的物理稳定性和氧化稳定性。结果表明,与TPI乳液比较,随着原料中大豆比例的增加,TSPC-DHA藻油乳液的平均粒径和乳析指数减小(P<0.05),Zeta电位绝对值增大(P<0.05),乳液的物理稳定性增强。与SPI乳液比较,贮藏过程中TSPC-DHA藻油乳液的过氧化值和硫代巴比妥酸反应物值明显较小(P<0.05),乳液的氧化稳定性明显改善。TSPC_(1∶1)和TSPC_(1∶2)乳液在4℃贮藏28 d无明显分层,氧化产物含量接近TPI乳液,乳液稳定性较好。初步分析,共沉淀蛋白中的大豆蛋白组分能更好地覆盖油水界面,提高了乳液贮藏的物理稳定性,而鱼蛋白组分能够减缓油脂的氧化速率,提高了乳液贮藏的氧化稳定性。TSPC乳液具有优于TPI乳液的物理稳定性和优于SPI乳液的氧化稳定性,可用作良好的乳化剂稳定DHA藻油。该研究结果可为共沉淀蛋白功能乳液的开发提供参考。

纤维蛋白原浓缩制剂和冷沉淀用于胎盘植入产妇重症产后出血的临床疗效比较

目的探讨在输注悬浮红细胞及新鲜冰冻血浆的前提下,比较纤维蛋白原浓缩制剂和冷沉淀对胎盘植入产妇重症产后出血的治疗效果。方法回顾性分析2009年1月—2021年6月本院3 h内出血量≥总血容量50%的胎盘植入产妇的临床资料,根据输血成分分为纤维蛋白原浓缩制剂组(A组)和冷沉淀组(B组),分析2组产妇的凝血功能情况、输血量、不良结局等资料。结果本研究共纳入201例胎盘植入重症产后出血产妇,其中A组产妇102例,B组99例;2组产妇输血后凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原水平与产前比较无差异(P>0.05);2组产妇悬浮红细胞(8.18±2.72)U vs(7.90±2.19)U、新鲜冰冻血浆(823.53±258.39)mL vs(804.04±224.94)mL等输血量比较无差异(P>0.05);2组产妇DIC(18.6%vs 21.2%)、子宫切除(26.5%vs 28.3%)、失血性休克(10.8%vs 13.1%)等发生率无差异(P>0.05)。结论在均输注悬浮红细胞及新鲜冰冻血浆的前提下,纤维蛋白原浓缩制剂与冷沉淀相比对胎盘植入产妇重症产后出血的治疗效果未见明显差异,但纤维蛋白原浓缩制剂具有可快速准备、保存及运输方便,减少血液制品的需求等优点。

姜蛋白脱除刺梨果汁中单宁的工艺研究

为有效脱除刺梨果汁(Rosa roxburghii juice)中的单宁,降低其涩味改善口感,该研究以刺梨果汁为对象,采用化学沉淀法,以姜蛋白为单宁脱除剂,并以单宁脱除率和维生素C(VC)保留率为考察指标,采用单因素实验和正交试验优化姜蛋白脱除单宁工艺确定最优工艺。结果表明:(1)姜蛋白脱除刺梨果汁单宁的最优工艺条件为液固比30∶1.2(mL∶g),刺梨果汁pH 3.0,搅拌温度5℃,搅拌时间30 min。(2)由正交试验分析可知,各因素对刺梨果汁脱除单宁的影响程度依次为液固比>搅拌温度>刺梨果汁pH>搅拌时间。(3)在最优工艺条件下,单宁脱除率为(47.451±0.608)%,VC保留率为(75.904±1.244)%。(4)在最优工艺条件下,果汁透光率从(8.44±0.662)%提高到(92.47±0.397)%,涩味明显改善,同时丰富了刺梨果汁风味。该研究结果为解决刺梨果汁深加工行业面临的共性关键技术问题提供了一个新思路和新工艺技术路线基础,也为拓展生姜资源的综合利用奠定了一定技术基础。

冷沉淀凝血因子融化后储存温度和时间对凝血因子的影响

目的 通过研究比较冷沉淀凝血因子融化后不同的储存温度和时间对凝血因子的影响,为行业标准的制定提供参考依据。方法 2021年6月—2023年5月,每月抽检4袋共96袋冷沉淀凝血因子,当月抽检并及时检测。冷沉淀凝血因子37℃水浴融化后对轻中度脂血予以标记,每袋冷沉淀凝血因子和2个50 mL转移袋用无菌接驳机分装成2袋2组各20 mL,1组放置4℃冰箱,另1组放置22℃水浴箱中,放置时间均为0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h,然后再各自时间无菌取样2 mL放入试管中,用加样枪在另1试管中加入样品1 mL和缓冲液3 mL混匀上机进行检测。随机选取60袋无轻中度脂血冷沉淀凝血因子的实验数据,采用SPSS21.0进行统计分析。结果 融化后的冷沉淀凝血因子贮放0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h检测2组凝血因子平均含量及增长率:(1)储存4℃,Ⅷ因子含量依次为118.62、111.57(-5.95%)、105.51(-11.05%)、103.30(-12.92%)、94.35(-20.46%)、83.25(-29.82%)IU/袋;储存22℃,Ⅷ因子含量依次为118.62、112.69(-5.00%)、111.41(-6.08%)、109.01(-8.10%)、101.55(-14.39%)、92.75(-21.81%)IU/袋,2组储存结果比较,在4℃24 h和22℃48 h,Ⅷ因子含量均有显著统计学意义(P<0.01),且在22℃储存,Ⅷ因子衰减速度更慢;(2)储存4℃,Ⅴ因子含量依次为41.19、41.31(0.29%)、40.52(-1.64%)、40.27(-2.23%)、39.05(-5.19%)、36.99(-10.21%)IU/袋;储存22℃,Ⅴ因子含量依次为41.19、41.71(1.25%)、42.54(3.28%)、41.94(1.80%)、39.21(-4.80%)、35.64(-13.48%)IU/袋,2组储存结果比较,在4℃48 h和22℃48 hⅤ因子含量分别有统计学意义(P<0.05)和有显著统计学意义(P<0.01),且在22℃储存,Ⅴ因子衰减速度更快;(3)储存4℃,Fbg含量依次为268.86、268.17(-0.26%)、262.46(-2.38%)、270.50(0.61%)、267.52(-0.50%)、261.92(-2.58%)mg/袋;储存22℃,Fbg含量依次为268.86、265.86(-1.12%)、264.12(-1.77%)、265.89(-1.11%)、266.04(-1.05%)、261.04(-2.91%)mg/袋,2组各时间段与0 h含量比对均无统计学意义(P>0.05)。结论 冷沉淀凝血因子融化后,凝血因子随储存时间延长而下降,尤其Ⅷ因子含量下降最明显,Ⅴ因子次之,Fbg基本不变。2组储存比较,22℃储存Ⅷ因子衰减速度更慢,Ⅴ因子衰减速度更快。冷沉淀凝血因子融化后应尽快输注;如果延迟不可避免,若延迟时间<12 h,采用4℃保存;若延迟时间介于12~24 h,采用22℃保存为宜。

早幼粒细胞白血病蛋白与TAK1结合蛋白相互作用的生物信息学分析与验证

目的通过生物信息学方法预测早幼粒细胞白血病蛋白与TAK1结合蛋白的相互作用,并通过免疫共沉淀方法进行实验验证。方法使用Rosetta软件,采用比较建模的方法,构建TAB1蛋白的三维模型;在PDB数据库中检索PML蛋白二级结构,并解析其晶体结构和三维结构。Zdock3.0.2软件进行PML与TAB1的蛋白-蛋白对接,并提取最佳构象进行对接模型的分子结构分析。α-MMC处理的M1炎性巨噬细胞,利用免疫共沉淀技术检测两种蛋白的相互作用。结果以PML的6IMQ为对接部位时,PML蛋白与TAB1蛋白能形成3个盐桥、6个氢键和6个疏水作用;以PML的5YUF为对接部位时,PML蛋白与TAB1蛋白能形成1个氢键、3个静电相互作用和9个疏水作用,两种对接模式皆能形成良好的分子对接和相互作用;在α-MMC处理4h后,其PML-IP组的细胞裂解沉淀液中分别能检测到显著的PML和TAB1阳性蛋白条带。结论PML蛋白与TAB1蛋白能发生较强的相互作用。

免疫沉淀联合质谱筛选与纳尔逊湾正呼肠孤病毒σNS互作的宿主RNA结合蛋白

目的筛选出宿主细胞中与纳尔逊湾呼肠孤病毒(NBV)非结构蛋白σNS互作的RNA结合蛋白并分析其生物信息学功能。方法本研究通过构建NBVσNS真核表达载体pEF-HA-MB-S3,验证正确后转染HEK293T细胞,所得的细胞蛋白裂解液经RNase A处理后,利用免疫沉淀富集σNS结合蛋白,经LC-MS/MS质谱分析技术鉴定分析互作蛋白,并且借助相关生信工具挖掘蛋白性质和具体功能。结果本实验成功筛选出32个与NBVσNS蛋白存在互作的候选RNA结合蛋白;生物分析结果显示,这些蛋白主要定位于细胞质与细胞核中,并且主要参与细胞代谢、生物调控、病毒翻译与转录等生物学过程。结论本研究初步分析与NBVσNS互作的RNA结合蛋白功能,为深入研究σNS蛋白在NBV生命周期中的作用机制奠定基础。

紫外交联免疫沉淀技术原理及其应用

紫外交联免疫沉淀(UV cross-linking immunoprecipitation,CLIP)技术最初建立于2003年。通过紫外交联、免疫沉淀、逆转录及后续的高通量测序等步骤,可在全转录组范围鉴定特定RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)的靶标RNA序列和结合位点。在近20年的应用过程中,该技术被不断改进和完善,可操作性、实验结果的准确性都有所提升,技术的应用范围也有所拓展。本文对CLIP技术的基本原理、实验方法、实际应用进行介绍,着重比较几种主流CLIP技术的异同,并对如何选择具体的技术路线提出建议。

酪蛋白磷酸肽-钙螯合物的分级、表征及持钙特性

利用酪蛋白磷酸肽螯合钙离子的特性,以钙离子浓度为尺度,分级制取不同钙螯合能力的CPPs,同时提高其纯度。以酪蛋白的胰蛋白酶酶解产物为原料,通过逐级增加Ca^(2+)添加量,在终浓度为55%(v/v)的乙醇溶液中分级沉淀出三个酪蛋白磷酸肽-钙螯合物级分(CPP1-Ca、CPP2-Ca和CPP3-Ca),并利用PBS脱钙得到三个级分相应的酪蛋白磷酸肽(CPP1、CPP2和CPP3)。以传统钙乙醇沉淀法得到的肽钙螯合物(CPP-Ca)为对照,分析并对比三个酪蛋白磷酸肽-钙螯合物级分的理化性质以及持钙特性。结果表明,三个酪蛋白磷酸肽-钙螯合物级分中,CPP3-Ca含有最高的纯度和钙螯合量,分别为89.42%和69.59 mg/g,明显高于未分级CPP-Ca的83.77%和55.05 mg/g。氨基酸组成及N/P(摩尔比)分析发现CPP3-Ca含有更高磷酸丝氨酸基团,进而能够结合更多的Ca^(2+)。不同酪蛋白磷酸肽级分持钙能力分析结果显示CPP3能够更好地延迟和阻止磷酸钙沉淀的形成,具有更高的持钙能力。同时CPP3-Ca在模拟肠道环境中具有更高的钙溶解度,表明分级后的酪蛋白磷酸肽-钙螯合物的体外生物利用度提高。

沉淀方法对污泥提取蛋白质的选择性及结构的影响分析

为提升污泥蛋白质的资源化利用,分别采用等电点沉淀法(Isoelectric Point Precipitation,IPP)、乙醇沉淀法(Ethanol Precipitation,EP)、硫酸铵沉淀法(Ammonium Sulfate precipitation,AS)以及联用沉淀法(Combined Precipitation,CP)分离蛋白质,用选择性因子α建立蛋白质、多糖、腐殖酸3者之间的数量关系,以考察不同沉淀方法中主导因素对蛋白质的选择性,并结合红外光谱分析其对蛋白质二级结构的影响以及蛋白质的应用潜能。结果表明:沉淀方法中的主导因素会对蛋白质的选择性及结构产生影响且所得蛋白质具有多重性。在主导因素pH=4.0、乙醇体积分数为40%、硫酸铵溶液饱和度为50%以及联用沉淀法时,蛋白质沉淀效率分别为84.76%、64.17%、65.84%和72.55%,选择性因子αPN/PS分别为3.11、4.22、3.80和6.51,均能显著分离蛋白质。在IPP、AS和CP分离得到的蛋白质中,污泥蛋白质以β-折叠结构为主。同时主导因素pH值与蛋白质中含醇羟基氨基酸的含量呈正相关;乙醇体积分数增加,蛋白质中含苯环氨基酸的含量减少,醇羟基氨基酸增加,且主要结构从β-折叠向α-螺旋转变;硫酸铵溶液饱和度的改变对蛋白质二级结构影响不显著。

乙型脑炎病毒非结构蛋白的表达及与hnRNP K的相互作用

【目的】为探明JEV病毒复制与宿主蛋白的关系。【方法】首先构建非结构蛋白质粒,然后将构建成功的非结构蛋白的质粒转染至Vero细胞中,24 h在荧光显微镜下观察蛋白表达情况,再分别与pCMV-MYC-hnRNP K质粒同时转染至Vero细胞中,培养24 h,收取细胞蛋白样,进行Co-IP试验相关步骤,用Western-blot实验进行结果呈现,得出试验结果。【结果】构建的非结构蛋白质粒在Vero细胞中可以表达,通过与表达hnRNP K蛋白的质粒共转染,通过Co-IP试验经Western-blot结果分析能够得出JEV的NS1与hnRNP K之间存在相互作用,JEV的NS2a、NS3、NS5与宿主hnRNP K之间不存在相互作用。【结论】JEV的NS1蛋白与宿主蛋白hnRNP K存在相互作用,为JEV非结构蛋白的研究进一步拓宽了思路,同时为JEV病毒在宿主细胞中的生命活动周期的研究提供了基础,为深入研究JEV病毒复制提供了新方向。

睾丸酮丛毛单胞菌激素降解关键酶3,17β-HSD蛋白质相互作用研究

为研究睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas Testosteroni,C.T.)ATCC11996降解甾体类激素过程中关键蛋白质的相互作用关系,本文利用基因同源重组及移码突变原理构建睾丸酮降解关键酶3,17β-HSD基因敲除突变株,在回收率95%条件下高效液相检测野生株与突变株睾丸酮降解率,突变株对睾丸酮降解能力明显低于野生株;原核表达3,17β-HSD获得浓度2.4 mg/mL纯化蛋白,制备特异性鼠源多克隆抗体,ELISA检测抗体效价1∶320000;将多克隆抗体与经睾丸酮诱导的野生型C.T.细胞裂解液蛋白质复合物进行免疫共沉淀,质谱测定蛋白质相互作用组,结果表明短链脱氢酶SDRy(WP_003078287.1)为睾丸酮降解过程中关键酶3,17β-HSD的主要相互作用蛋白。

人纤维蛋白原与冷沉淀治疗肿瘤相关获得性纤维蛋白原缺乏症的疗效比较

获得性纤维蛋白原缺乏症(AFD)是肿瘤患者常见凝血疾病,其病理机制复杂,可引起出血事件,若未及时治疗,可造成严重后果。肿瘤相关AFD治疗以有效补充纤维蛋白原,改善凝血功能,尽快控制出血为原则,目前临床主要采用替代疗法。冷沉淀是从全血中分离的血液成分制品,其中包含多种凝血因子,在外科手术、血液疾病治疗、危急重症抢救中应用较广[1]。

直接蛋白沉淀-超高效液相色谱法测定氟尿嘧啶血药浓度

目的:分析直接蛋白沉淀-超高效液相色谱法测定氟尿嘧啶血药浓度。方法:采用浓度为6%高氯酸作为沉淀剂,内标物为5氟尿嘧啶,在震荡处理之后,采用高速离心方式,供试剂作为上清液。采用quity HSS T,色谱柱测定供试剂,流动相为乙腈,流动速度为每分钟0.2mL,5μL为进样量,将柱温设置为20℃。结果:方法的线性、专属性和精密度等指标,均符合定量测定要求。与传统测定方法进行比较,进样分析时间得以缩短,试剂样本降低。检测静脉滴注氟尿嘧啶的血药浓度。临床研究显示,胃癌患者血药浓度控制在25.6~37.4μg/mL时,不良反应发生率较小,同时具有良好效果,氟尿嘧啶的血药浓度大于3μg/mL时,患者出现不良反应发生率较高。在本次研究中,有1例患者的血药峰浓度低于20μg/mL,治疗效果较差,1例患者血药谷浓度大于3μg/mL,患者出现严重黏膜损害,甚至发生骨髓抑制反应。通过与医护人员进行沟通,调整治疗方案,患者再次治疗后产生的不良反应降低。结论:此种方法用于检测临床患者的血药浓度,临床应用前景良好。

蛋清卵黏蛋白提取工艺优化

卵黏蛋白是鸡蛋清中具有抗菌、降胆固醇及免疫活性的蛋白质。该文以新鲜鸡蛋清为原料,通过盐析沉淀法和等电点法结合提取卵黏蛋白,采用响应面法优化提取工艺。结果表明:蛋清中提取卵黏蛋白的最佳工艺条件为NaCl溶液浓度1.5 mol/L,以4倍蛋清体积的NaCl溶液,调节蛋清pH值至5.5,离心40 min,取沉淀重悬,在上述相同离心条件下再次离心并冻干沉淀得到卵黏蛋白,提取率为54.48%,纯度为94.26%。

鸡腺苷琥珀酸裂解酶互作蛋白的筛选及其功能分析

通过探究鸡腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase)基因ADSL与其互作基因的调控关系,为进一步研究ADSL在肌肉中高表达的原因和ADSL影响肌肉风味的机制提供参考。本研究构建了鸡(gallus)ADSL基因的重组真核表达载体pEGFP-C1-ADSL,将pEGFP-C1-ADSL和pEGFP-C1质粒分别转染鸡成肌细胞,提取表达成功的细胞总蛋白,利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)联合质谱分析鉴定与鸡ADSL蛋白互作的细胞蛋白,并对结果进行GO功能注释、KEGG通路和蛋白互作网络分析。通过分析筛选出RPL4、PDLIM5、ACTG1和SRSF10蛋白,检测在ADSL基因过表达和沉默状态下,RPL 4、PDLIM 5、ACTG 1和SRSF 10基因在成肌细胞中的表达情况。结果表明,与ADSL互作的蛋白共94个;生物信息学分析表明,这些蛋白定位于细胞结构体、胞内和含蛋白质的复合物上,它们主要参与细胞进程、生物调节和刺激反应等生物进程。间接免疫荧光结果显示,重组蛋白pEGFP-C1-ADSL主要定位于细胞核和细胞质。ADSL过表达时,成肌细胞内RPL 4基因和PDLIM 5基因的表达下调,ACTG 1和SRSF 10基因的表达上调;当ADSL被沉默后,成肌细胞内RPL 4和ACTG 1基因的表达上调。研究结果丰富了调控风味的ADSL蛋白,为进一步了解ADSL的功能及该基因在肌肉中高表达提供了参考。