沉默信息调节因子1/叉头框蛋白O1信号通路调控铁死亡对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞的影响实验研究

目的:探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)/叉头框蛋白O1(FOXO1)信号通路调控铁死亡对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞的影响。方法:将30只雌性SD大鼠分为对照组(皮下注射豆油)和PCOS组(皮下注射脱氢表雄酮)。将对照组和PCOS组大鼠分离得到的卵巢颗粒细胞分为对照组、PCOS组,取一半PCOS组卵巢颗粒细胞为过表达SIRT1组(20μmol/L SIRT1激活剂SRT 2183干预)。RT-qPCR及Western blot检测细胞中SIRT1、FOXO1、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)mRNA及蛋白表达。Hoechst染色检测细胞活性氧(ROS)及线粒体活性氧(mtROS)水平。ELISA检测细胞中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、Fe^(2+)、卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)、黄体生成素(LH)水平。流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:与对照组比较,PCOS组卵巢颗粒细胞中SIRT1、FOXO1、SLC7A11、GPX4、Bcl-2 mRNA及蛋白表达和GSH、FSH水平降低,Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达和MDA、ROS、mtROS、Fe^(2+)、T、LH水平升高,卵巢颗粒细胞凋亡率增加(均P<0.05)。与PCOS组比较,过表达SIRT1组卵巢颗粒细胞中SIRT1、FOXO1、SLC7A11、GPX4、Bcl-2 mRNA及蛋白表达和GSH、FSH水平升高,Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达和MDA、ROS、mtROS、Fe^(2+)、T、LH水平降低,卵巢颗粒细胞凋亡率减少(均P<0.05)。结论:SIRT1/FOXO1通路在PCOS卵巢颗粒细胞中下调,激活该通路可能通过下调铁死亡抑制PCOS卵巢颗粒细胞凋亡。

2型糖尿病病人血清沉默信息调节因子2相关酶1和叉头样转录因子O4表达与糖尿病视网膜病变的关系

目的探究2型糖尿病(T2DM)病人血清沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)和叉头样转录因子O4(FOXO4)表达与糖尿病视网膜病变(DR)的关系。方法采用随机数字表法将2021年8月至2022年8月在七台河市人民医院收治的142例T2DM病人纳入研究,按照国际临床DR严重程度量表分为无DR组62例、非增殖性(NPDR)组50例和增殖性(PDR)组30例。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清SIRT1和FOXO4的表达水平;Pearson法分析血清中SIRT1和FOXO4表达水平的相关性;logistic回归分析影响T2DM病人DR发生的因素。ROC曲线分析血清中SIRT1和FOXO4对T2DM病人DR发生的诊断价值。结果PDR组高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)[(1.22±0.15)mmol/L比(1.98±0.17)mmol/L、(1.64±0.18)mmol/L]、SIRT1水平[(3.82±0.50)μg/L比(5.36±0.56)μg/L、(4.65±0.52)μg/L]显著低于无DR组及NPDR组,NPDR组显著低于无DR组;PDR组收缩压(SBP)、三酰甘油(TG)、FOXO4[(14.63±1.48)μg/L比(12.62±1.45)μg/L、(13.74±1.46)μg/L]水平显著高于无DR组及NPDR组,NPDR组显著高于无DR组(P<0.05)。相关性分析显示,血清SIRT1和FOXO4表达水平呈负相关关系(r=−0.47,P<0.001)。logistic回归分析显示,HDL-C、SIRT1和FOXO4表达水平是影响T2DM病人DR发生的因素(P<0.05)。二者联合诊断DR发生的ROC曲线下面积(AUC)高于SIRT1和FOXO4单独诊断的AUC值(Z=32.22,P<0.001;Z=19.03,P<0.001)。结论T2DM病人血清中SIRT1表达水平显著降低,FOXO4表达水平显著升高,二者是影响T2DM病人DR发生的因素。

鹿茸多肽对骨质疏松模型大鼠的改善作用及对SIRT1/FOXO1信号通路的影响

目的:探讨鹿茸多肽(VAP)对骨质疏松(OP)模型大鼠的保护作用,并阐明其可能的作用机制。方法:60只12周龄SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药组(1 mg·kg^(-1)·d^(-1)阿仑膦酸钠灌胃)、低剂量(100 mg·kg^(-1)·d^(-1))VAP组、中剂量(200 mg·kg^(-1)·d^(-1))VAP组和高剂量(300 mg·kg^(-1)·d^(-1))VAP组,每组10只。除对照组外,其余各组大鼠肌肉注射地塞米松(2 mg·kg^(-1))复制OP大鼠模型,对照组大鼠肌肉注射等体积生理盐水,每周2次,连续11周。双能X射线骨密度仪检测各组大鼠股骨骨密度(BMD),酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组大鼠血清中血钙(Ca^(2+))、血磷(P)、骨保护素(OPG)、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)水平,生化法检测各组大鼠血清中丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性,HE染色观察各组大鼠骨组织病理形态表现,Western blotting法检测各组大鼠骨组织中沉默信息调节因子1(SIRT1)、过氧化氢酶(CAT)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和叉头框蛋白O1(FOXO1)蛋白表达水平。结果:与对照组比较,模型组大鼠股骨BMD明显降低(P<0.05);与模型组比较,阳性药组、中剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠股骨BMD明显升高(P<0.05或P<0.01)。与对照组比较,模型组大鼠血清中Ca^(2+)、P和OPG水平及SOD活性明显降低(P<0.05),ALP、OCN和MDA水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,低剂量VAP大鼠血清中OPG水平明显升高(P<0.05),阳性药组、中剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠血清中Ca^(2+)、P和OPG水平及SOD活性明显升高(P<0.05或P<0.01),阳性药组和各剂量VAP组大鼠血清中ALP、OCN和MDA水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。HE染色,与对照组比较,模型组大鼠骨组织中骨细胞数量减少且排列混乱,骨小梁纤细,出现大片断裂,髓腔扩大;与模型组比较,阳性药组、中剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠骨组织中骨小梁粗壮,排列紧密。Western blotting法,与对照组比较,模型组大鼠骨组织中SIRT1、CAT、RUNX2和FOXO1蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,阳性药组、中剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠骨组织中SIRT1、CAT、RUNX2和FOXO1蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:VAP对OP模型大鼠具有保护作用,其作用机制可能与介导SIRT1/FOXO1信号通路抗氧化应激作用有关。

白花丹素介导sirt1-FOXO1通路对糖尿病肾病大鼠氧化应激损伤的影响

目的探究白花丹素通过沉默信息调节因子2相关酶(sirt)1-叉头框蛋白(FOX)O1通路对糖尿病肾病(DN)大鼠氧化应激损伤的影响。方法120只SD大鼠随机分为对照组、DN组、白花丹素低剂量组、白花丹素高剂量组、EX-527组(sirt1抑制剂,5 mg/kg)、白花丹素高剂量+EX-527组,每组20只。检测大鼠24 h尿蛋白、空腹血糖(FBG)、血肌酐(SCr)、血β2微球蛋白(β2-MG)及肾组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平;测定大鼠左肾指数;过碘酸雪夫(PAS)染色观测肾脏病理变化;TUNEL法检测肾组织细胞凋亡;Western印迹法检测sirt1-FOXO1通路相关蛋白表达。结果与对照组相比,DN组24 h尿蛋白、FBG、Scr、β2-MG水平、左肾指数、MDA、IL-1β、IL-6水平均显著升高,肾组织匀浆SOD、CAT水平、肾组织sirt1、FOXO1蛋白均显著降低(P<0.05)。与DN组相比,白花丹素低、高剂量组24 h尿蛋白、FBG、Scr、β2-MG水平、左肾指数、MDA、IL-1β、IL-6水平均显著降低,肾组织匀浆SOD、CAT水平、肾组织sirt1、FOXO1蛋白显著升高(P<0.05);EX-527组24 h尿蛋白、FBG、Scr、β2-MG水平、左肾指数、MDA、IL-1β、IL-6水平均显著升高,肾组织匀浆SOD、CAT水平、肾组织sirt1、FOXO1蛋白均显著降低(P<0.05);EX-527可部分削弱白花丹素高剂量对DN大鼠氧化应激损伤的缓解作用。结论白花丹素可能通过激活sirt1-FOXO1通路,缓解DN大鼠氧化应激损伤。

Slit引导配体2通过调控AMPK/SIRT1-FoxO1信号通路影响糖尿病小鼠视网膜血管损伤的机制研究

目的 探讨Slit引导配体2(SLIT2)是否通过调控腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)/转录沉默信息调节因子1(SIRT1)-叉头盒蛋白O1(FoxO1)信号通路通过对糖尿病小鼠视网膜血管损伤的影响。方法 30只db/db小鼠随机分为DR组(db/db小鼠)、DR+阴性对照载体组(DR+sh-NC组)和DR+sh-SLIT2组,每组10只。另选10只db/m小鼠为对照组。DR+sh-NC组和DR+sh-SLIT2组麻醉后分别在双眼玻璃体腔内注射sh-SLIT2的腺相关病毒(AAV)载体。眼底荧光血管造影(FFA)和苏木精伊红染色观察视网膜血管病变;酶联免疫吸附测定检测血清白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)的水平,荧光定量PCR检测SLIT2 mRNA表达;Western blot检测视网膜组织SLIT2、AMPK、SIRT1、FoxO1蛋白水平。结果 与对照组相比,DR组、DR+sh-NC组、DR+sh-SLIT2组血糖、每日饮水量、每日排尿量、食物摄入量及体质量均明显升高(P<0.05);与对照组相比,DR组视网膜存在血管病变及病理损伤,SLIT2 mRNA及蛋白表达、IL-6、TNF-α和VEGF水平,FoxO1蛋白水平均明显升高(P<0.05),AMPK、SIRT1蛋白水平均明显降低(P<0.05);与DR+sh-NC组相比,DR+sh-SLIT2组的视网膜血管病变及病理损伤明显减轻,SLIT2 mRNA及蛋白表达、IL-6、TNF-α和VEGF水平,FoxO1蛋白水平均明显降低(P<0.05),AMPK、SIRT1蛋白水平均明显升高(P<0.05)。结论 沉默SLIT2表达显著改善糖尿病小鼠视网膜血管损伤及炎症水平,这可能是通过调控AMPK/SIRT1-FoxO1信号通路发挥作用的。

基于SIRT1/FOXO3a信号通路探讨“温阳通脉”灸法对ApoE^(-/-)动脉粥样硬化小鼠炎症反应的影响

【目的】探讨“温阳通脉”灸法防治动脉粥样硬化(AS)的作用机制。【方法】将10只饲喂普通饲料的C57BL/6J小鼠设为空白组;将30只ApoE^(-/-)小鼠给予高脂饲料喂养建立动脉粥样硬化模型,随机分为模型组、辛伐他汀组和艾灸组,每组10只。于造模第1天开始干预,艾灸组小鼠给予膻中、神阙、内关、血海穴艾灸,辛伐他汀组给予辛伐他汀蒸馏水混悬液灌胃,共干预12周。给药结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察小鼠胸主动脉病理形态结构,透射电镜观察小鼠胸主动脉内皮细胞超微结构,酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)水平,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测胸主动脉沉默信息调节因子1(SIRT1)和叉头框转录因子O3a(FOXO3a)的mRNA表达水平,Western Blot法检测胸主动脉SIRT1和FOXO3a蛋白表达水平。【结果】与空白组比较,模型组小鼠胸主动脉及血管内皮细胞病理变化明显,血清炎症因子TNF-α、ICAM-1和VCAM-1水平升高(P<0.05或P<0.01),胸主动脉SIRT1 mRNA和蛋白表达量降低(P<0.01),FOXO3a mRNA和蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,辛伐他汀组和艾灸组小鼠的胸主动脉及血管内皮细胞结构得到明显改善,血清TNF-α、ICAM-1、VCAM-1水平均降低(P<0.05),胸主动脉SIRT1 mRNA和蛋白表达量增加(P<0.05或P<0.01),FOXO3a mRNA和蛋白表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。辛伐他汀组和艾灸组上述指标组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。【结论】“温阳通脉”灸法可通过调控SIRT1/FOXO3a信号通路减轻炎症反应防治小鼠AS。

足细胞SIRT1/FoxO3自噬通路与糖尿病肾脏疾病关系的研究进展

糖尿病肾脏疾病(DKD)是糖尿病微血管并发症之一,也是目前全球范围内导致终末期肾病的首要原因,足细胞在DKD发病机制中发挥重要作用,而自噬对维持足细胞生存及内环境稳定具有重要意义。因此,自噬及相关通路是DKD的潜在治疗干预靶点。沉默信息调节因子1通过介导叉头框转录因子O3的去乙酰化,激活足细胞自噬相关通路,调节自噬相关基因和氧化应激反应,维持足细胞结构和功能,从而延缓DKD的进展。未来对足细胞自噬相关通路与DKD发病机制的关系进行深入探索,将为DKD的临床诊断和靶向治疗提供新思路。

基于Sirt1/FoxO1通路探讨瑞马唑仑减轻脓毒症小鼠脑损伤的机制研究

目的探究瑞马唑仑对脓毒症引起的脑损伤的影响及机制。方法雄性C57BL/6J小鼠,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、瑞马唑仑组(8 mg/kg)、瑞马唑仑+Sirt1抑制剂(EX527)组(8 mg/kg瑞马唑仑+5 mg/kg EX527)、EX527组,每组38只。采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制备脓毒症相关性脑病(SAE)小鼠模型。给予相应的干预后,观察并记录术后7 d内小鼠存活率,采用Morris水迷宫检测小鼠逃避潜伏期和穿越平台次数;手术后24 h,通过伊文斯蓝(EB)渗漏量评估血脑屏障(BBB)通透性,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测脑组织白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β水平,化学比色法检测脑组织丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,HE染色观察海马组织病理学变化,TUNEL法检测神经元凋亡,蛋白免疫印迹(Western Blot)检测海马组织沉默信息调节因子1(Sirt1)/叉头框蛋白O1(FoxO1)通路相关蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组小鼠的存活率、穿越平台次数、SOD和CAT活性、Sirt1和胞质NF-κB p65蛋白水平显著下降,逃避潜伏期、脑组织EB含量、IL-6、TNF-α、IL-1β和MDA水平、海马神经元凋亡指数、乙酰化FoxO1(Ac-FoxO1)/FoxO1比值和乙酰化核因子-κB p65(Ac-NF-κB p65)、胞核NF-κB p65蛋白水平显著升高(均P<0.05);与模型组相比,瑞马唑仑组小鼠的存活率、穿越平台次数、SOD和CAT活性、Sirt1和胞质NF-κB p65蛋白水平显著升高,逃避潜伏期、脑组织EB含量、IL-6、TNF-α、IL-1β和MDA水平、海马神经元凋亡指数、Ac-FoxO1/FoxO1比值和Ac-NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白水平显著降低(均P<0.05);EX527可抑制Sirt1表达,显著减弱瑞马唑仑对SAE小鼠的上述保护作用(均P<0.05)。结论瑞马唑仑可提高脓毒症小鼠存活率,通过维持BBB完整性、抑制神经炎症和氧化应激,减少神经元凋亡,减轻脓毒症引起的脑损伤;其作用机制可能与激活Sirt1/FoxO1通路,抑制NF-κB活化有关。

黄芪多糖调控Sirt1/FoxO1通路抑制多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞自噬的研究

目的探究黄芪多糖(APS)调控沉默信息调节因子1/叉头状转录因子O1(Sirt1/FoxO1)通路对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠颗粒细胞自噬的影响。方法大鼠中分离卵巢颗粒细胞并经促卵泡刺激素受体(FSHR)免疫荧光鉴定,且CCK8检测APS对卵巢颗粒细胞增殖的影响。10-5mol/L丙酸睾丸酮、10μmol/L C2-神经酰胺作用大鼠卵巢颗粒细胞24 h诱导PCOS大鼠颗粒细胞自噬模型,CCK8检测细胞增殖情况;透射电镜观察自噬体情况;免疫印迹法检测细胞中Sirt1、Fox O1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达情况。结果免疫荧光检测显示,FSHR蛋白在大鼠卵巢颗粒细胞中的平均阳性表达量93.18%>90%,可进行接下来实验。0、100、200、400μg/mL APS处理正常卵巢颗粒细胞,在贴壁0、24 h比较,细胞OD450差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比,模型组细胞核附近出现大量自噬小体,双层、单层膜包裹胞质形成封闭、圆形结构,部分自噬小体内膜溶解,自噬小体周围可见单层膜结构包裹着一些被降解的胞浆、类似自噬小体结构;100μg/mL APS组与模型组细胞结构类似,随着APS剂量的升高,自噬小体数量减少,在400μg/m L APS组时细胞正常。正常组、模型组、100、200、400μg/mL APS组在细胞贴壁0 h时,细胞OD450差异无统计学意义(P>0.05)。细胞贴壁24 h,与正常组相比,模型组细胞OD450降低(P<0.05),细胞中Sirt1、Fox O1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,100、200、400μg/mL APS组细胞OD450升高(P<0.05),细胞中Sirt1、Fox O1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平降低(P<0.05)。结论APS可以抑制PCOS大鼠颗粒细胞自噬,可能是通过抑制自噬通路Sirt1/FoxO1实现的。

红景天苷调控FoxO1/β-catenin通路对2型糖尿病骨质疏松大鼠的保护作用研究

目的探讨红景天苷(SDS)对2型糖尿病骨质疏松(DOP)大鼠的保护作用及叉头框转录因子O亚族1(Fox O1)/β-连环蛋白(β-catenin)通路的影响。方法高糖高脂饲养8周,8周后腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素(STZ),第10周无菌条件下去除卵巢构建DOP大鼠模型,建模成功后随机分为模型组、SDS组、Fox O1激动剂组,每组8只;正常组8只大鼠常规饲料正常饲养相同时间。造模成功后第2天予SDS组灌胃36 mg/(kg·d) SDS,Fox O1激动剂组灌胃40 mg/(kg·d)白藜芦醇(Res),连续11周。血糖仪检测空腹血糖水平;苏木精-伊红(HE)检测大鼠股骨组织形态;双能X射线吸收法测定股骨组织骨密度情况;活性氧(ROS)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒检测血清中ROS、SOD、MDA、GSH-Px水平;蛋白免疫印迹检测股骨组织中Fox O1、β-catenin蛋白水平。结果建模后给药前,与正常组相比,模型组、SDS组、Fox O1激动剂组空腹血糖水平升高(P<0.05)。给药后,模型组骨小梁出现明显断裂、破坏严重、数量减少;SDS组、Fox O1激动剂组骨小梁明显断裂,但空隙间隔有所缓解,数量有所增加。与正常组相比,模型组空腹血糖水平,血清中ROS、MDA水平升高(P<0.05);股骨组织骨密度,血清中SOD、GSH-Px水平,股骨组织中Fox O1、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)。与模型组相比,SDS组、Fox O1激动剂组空腹血糖水平,血清中ROS、MDA水平降低(P<0.05);股骨组织骨密度,血清中SOD、GSH-Px水平,股骨组织中Fox O1、β-catenin蛋白水平升高(P<0.05)。结论SDS可激活Fox O1/β-catenin通路,增强抗氧化应激作用,实现对DOP大鼠的保护。

蓝萼甲素对急性髓系白血病U937细胞增殖、凋亡、自噬及SIRT1/FoxO1信号通路的影响

目的:探究蓝萼甲素对急性髓系白血病(AML)U937细胞增殖、凋亡、自噬及沉默信息调节因子1(SIRT1)/叉头框转录因子O1(FoxO1)信号通路的影响。方法:体外培养AML U937细胞,取培养至对数生长期的U937细胞分为对照组(常规培养U937细胞)、三氧化二砷组(在含U937细胞的培养基中加入2μmol/L的三氧化二砷)、蓝萼甲素低(在含U937细胞的培养基中加入2μmol/L蓝萼甲素)、高(在含U937细胞的培养基中加入4μmol/L蓝萼甲素)浓度组,继续培养48 h后。四甲基偶氮唑蓝法检测U937细胞增殖率,流式细胞术检测U937细胞凋亡率,单丹磺酰尸胺荧光染色观察U937细胞自噬小体数量,荧光定量PCR法检测U937细胞SIRT1、FoxO1 mRNA表达水平,蛋白印迹法检测U937细胞SIRT1、FoxO1蛋白表达水平。结果:与对照组相比,三氧化二砷组、蓝萼甲素低、高浓度组U937细胞增殖率显著降低(均P<0.05),凋亡率、自噬小体数量、SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白表达水平显著升高(均P<0.05);与三氧化二砷组相比,蓝萼甲素低、高浓度组U937细胞增殖率显著升高(均P<0.05),凋亡率、自噬小体数量、SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(均P<0.05);与蓝萼甲素低浓度组相比,蓝萼甲素高浓度组U937细胞增殖率显著降低(P<0.05),凋亡率、自噬小体数量、SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。结论:蓝萼甲素能抑制U937细胞的增殖,促进其凋亡和自噬,其机制可能与激活SIRT1/FoxO1信号通路有关。

白藜芦醇通过调控沉默信息调节因子1/叉头框转录因子O1通路保护白细胞介素-1β诱导的软骨细胞损伤

目的探讨白藜芦醇(RES)对IL-1β诱导的软骨细胞的影响及其作用通路。方法提取Wistar乳鼠软骨细胞,实验分为5组:对照组,IL-1β组,RES+IL-1β组,RES+IL-1β+EX-527[沉默信息调节因子1(SIRT1)抑制剂]组,RES+IL-1β+AS[叉头框转录因子O1(FOXO1)抑制剂]组。采用实时荧光定量(qRT)-PCR检测SIRT1、FOXO1和MMP-3 mRNA表达量。免疫荧光技术检测软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白(Col-Ⅱ)的蛋白表达,蛋白质免疫印迹技术检测软骨细胞SIRT1,p-FOXO1/FOXO1的蛋白表达。ELISA检测软骨细胞炎性因子IL-6和TNF-α分泌量。计量资料多组间比较行单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t法。以P<0.05差异具有统计学意义。结果与正常软骨细胞相比,IL-1β诱导的软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白、SIRT1、FOXO1和p-FOXO1/FOXO1的mRNA和蛋白表达明显降低,细胞TNF-α[(24.70±2.84),t=19.24,P<0.001]和IL-6的分泌量[(3.35±0.28),t=12.97,P<0.001]明显升高、MMP-3的mRNA表达[(2.46±0.23),t=12.61,P<0.001]明显升高。RES作用于IL-1β诱导软骨细胞后,Ⅱ型胶原蛋白、SIRT1、FOXO1和p-FOXO1/FOXO1的mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.001),细胞TNF-α[(12.60±1.05),t=10.14,P<0.001]和IL-6[(2.00±0.15),t=9.89,P<0.001]的分泌量明显降低,MMP-3的mRNA表达[(1.30±0.14),t=10.46,P<0.001]明显降低。加入SIRT1抑制剂EX-527或FOXO1抑制剂AS后,RES对IL-1β诱导软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白、SIRT1、FOXO1和p-FOXO1/FOXO1的mRNA和蛋白表达的促进作用明显降低(P<0.05),对TNF-α和IL-6的分泌量抑制作用明显下降(P<0.001),对MMP-3的mRNA表达抑制作用明显下降(P<0.05)。结论RES通过SIRT1/FOXO1通路可明显改善IL-1β诱导的软骨细胞外基质降解和炎症反应。

分拣蛋白过表达通过沉默信息调节因子1/叉头盒蛋白O1通路减轻氧化型低密度脂蛋白诱导的肝窦内皮细胞内吞功能障碍的研究

目的探讨分拣蛋白(Sortilin)参与调控氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人肝窦内皮细胞(HLSECs)内吞功能障碍的作用机制。方法体外培养HLSECs,构建Sortilin慢病毒过表达载体(LV-Sortilin)及慢病毒空载体(LV-Con)并转染HLSECs。将细胞分为正常对照(NC)组、ox-LDL组、LV-Sortilin组和LV-Con组。LV-Sortilin及LV-Con感染HLSECs后,加入100μg/ml ox-LDL培养HLSECs 24 h,记为ox-LDL+LV-Sortilin组和ox-LDL+LV-Con组。分别用10μmol/L的EX527和1μmol/L的AS1842856处理LV-Sortilin和LV-Con感染的HLSECs 24 h后,记为ox-LDL+LV-Sortilin+EX527组、ox-LDL+LV-Con+EX527组、ox-LDL+LV-Sortilin+AS1842856组、ox-LDL+LV-Con+AS1842856组。荧光显微镜、RT-PCR和Western blot判断转染效率,CCK-8检测HLSECs活力,RT-PCR和Western blot检测各组Sortilin、沉默信息调节因子1(SIRT1)、叉头盒蛋白O1(FoxO1)、小窝蛋白1(CAV-1)mRNA和蛋白表达。结果LV-Sortilin重组体感染细胞72 h后,LV-Sortilin、LV-Con组细胞出现大量绿色荧光,NC组细胞无绿色荧光。LV-Sortilin组Sortilin mRNA和蛋白表达高于NC组(P<0.05)。与NC组比较,ox-LDL组Sortilin、SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),CAV-1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),Ac-FoxO1蛋白表达升高(P<0.05)。与ox-LDL组、ox-LDL+LV-Con组比较,ox-LDL+LV-Sortilin组Sortilin、SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),CAV-1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),Ac-FoxO1蛋白表达降低(P<0.05)。与ox-LDL+LV-Sortilin组比较,ox-LDL+LV-Sortilin+EX527、ox-LDL+LV-Sortilin+AS1842856组SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),CAV-1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),Ac-FoxO1表达升高(P<0.05)。结论Sortilin通过SIRT1/FoxO1途径调控CAV-1表达进而调控ox-LDL诱导的HLSECs内吞功能障碍,过表达Sortilin可抑制该病理反应。

活动性肺结核患者巨噬细胞相关细胞因子与外周血单个核细胞中沉默信息调节因子1和叉头框蛋白O3水平的相关性

目的探究活动性肺结核(active pulmonary tuberculosis,APTB)患者外周血单个核细胞中沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)、叉头框蛋白O3(forkhead box protein O3,FOXO3)水平与巨噬细胞相关细胞因子诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)的相关性。方法选取2020年1月—2021年12月期间于重庆医科大学附属第一医院渝北医院接受治疗的64例APTB患者为APTB组,选取59例潜伏结核感染(LTBI)者为LTBI组,同期选取62例健康体检人群作为对照组。实时荧光定量PCR(qPCR)法进行外周血单个核细胞中SIRT1 mRNA、FOXO3 mRNA水平检测,ELISA法进行血清iNOS、Arg-1水平检测;采用ROC曲线分析SIRT1 mRNA、FOXO3 mRNA水平对LTBI、APTB的鉴别诊断价值;采用Pearson相关分析APTB患者外周血单个核细胞SIRT1 mRNA、FOXO3 mRNA与血清iNOS、Arg-1水平相关性。结果对照组、LTBI组、APTB组外周血单个核细胞SIRT1 mRNA、FOXO3 mRNA及血清iNOS水平依次降低,血清Arg-1水平依次升高(P<0.05)。SIRT1 mRNA、FOXO3mRNA水平鉴别诊断LTBI、APTB的AUC分别为0.876、0.887,灵敏度分别为71.2%、76.3%,特异度分别为96.9%、90.6%。APTB患者外周血单个核细胞SIRT1 mRNA与FOXO3 mRNA水平呈正相关(r=0.500,P<0.05),且二者与血清iNOS呈正相关,与血清Arg-1呈负相关(P<0.05)。APTB患者治疗6个月后外周血单个核细胞SIRT1 mRNA、FOXO3 mRNA及血清iNOS高于治疗前,血清Arg-1低于治疗前(P<0.05)。结论APTB患者外周血单个核细胞中SIRT1 mRNA、FOXO3mRNA水平较低,且二者与巨噬细胞相关细胞因子iNOS呈正相关,与Arg-1呈负相关。

依托咪酯调控Sirt1/FOXO1通路对心肌缺血再灌注大鼠模型的保护作用

目的基于沉默信息调节因子1(Sirt1)/叉头框转录因子O亚族1(FOXO1)通路探究依托咪酯(Eto)对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠模型的保护作用。方法将60只大鼠随机分为假手术组(Sham组)、MIRI组、依托咪酯低、高剂量组(L-Eto、H-Eto组,0.5、1 mg/kg)、通路抑制剂组(Eto+EX527组,1 mg/kg Eto+2 mg/kg EX527),每组12只。除Sham组外,其余大鼠采用手术结扎冠状动脉左前降支的方法复制大鼠MIRI模型。给药组大鼠于再灌注后2 h尾静脉注射相应剂量药物;1次/d,持续28 d。于手术前和末次给药2 h后超声心电图检查大鼠心脏功能;生化法检测血清中肌酸激酶同工酶MB(CKMB)、肌钙蛋白I(cTnI)、乳酸脱氢酶(LDH)水平和心肌组织匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平;苏木精-伊红(HE)染色观察心脏组织形态变化;流式细胞术检测心肌细胞凋亡;荧光探针测定心肌中活性氧(ROS)水平;JC-1法检测线粒体膜电位(MMP)变化;Western blot检测心肌组织Sirt1/FOXO1通路和凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)的表达。结果与Sham组相比,MIRI组大鼠左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室收缩末期容积(LVESV)、血清CKMB、cTnI、LDH水平、心肌MDA水平、心肌细胞的凋亡率、ROS水平、心肌乙酰化FOXO1(Ac-FOXO1)、Bax、Caspase-3的表达显著升高(均P<0.05),左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)、心肌SOD、GSH-Px水平、MMP、心肌Sirt1、Bcl-2的表达显著下降(均P<0.05),心肌纤维紊乱,细胞肿胀、坏死,大量炎性细胞浸润;与MIRI组相比,L-Eto、H-Eto组大鼠的LVESV、LVEDV、血清CKMB、cTnI、LDH水平、心肌MDA水平、心肌细胞的凋亡率、ROS水平、心肌Ac-FOXO1、Bax、Caspase-3的表达明显下降(均P<0.05),LVEF、LVFS、心肌SOD、GSH-Px水平、MMP、Sirt1、Bcl-2的表达明显升高(均P<0.05);心肌损伤明显减轻。EX527可逆转Eto的抗氧化活性和心肌保护作用。结论Eto对MIRI的保护作用可能与激活Sirt1,下调乙酰化FOXO1的表达,进而改善线粒体功能障碍,抑制氧化应激和细胞凋亡有关。

大黄素调控sirt1/FOXO1通路减轻脑卒中相关性肺炎大鼠的肺损伤

目的观察大黄素对脑卒中相关性肺炎大鼠肺损伤的影响及对沉默信息调节因子(sirt)1/叉头框蛋白(FOX)O1通路的调控作用。方法取SD大鼠75只,分为假手术组、模型组、大黄素(50 g/kg)组、sirt1抑制剂-烟酰胺(NA,100 mg/kg)组、大黄素+NA组(50 g/kg大黄素+100 mg/kg NA)组,每组15只;采用四动脉阻断法制备脑卒中相关肺炎大鼠模型,于造模成功后连续给药7 d,1次/d。末次给药后观察大鼠一般行为;肺功能分析系统检测肺阻力(R)、肺顺应性(Cdyn),肺活量(FVC);血液分析系统检测肺泡灌洗液中淋巴细胞和巨噬细胞数量;流式细胞仪检测外周血辅助性T细胞(Th)17/调节性T细胞(Treg)水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆儿茶酚胺含量;苏木素-伊红(HE)染色检测肺组织病理变化;烘干法检测肺湿/干重;免疫荧光共定位检测肺组织FOXO1磷酸化(p-FOXO1)与Ⅱ型肺泡上皮细胞标记蛋白-肺表面活性蛋白(SP)C阳性共表达水平;免疫组化法检测肺组织sirt1阳性表达水平;Western印迹检测肺组织α亚基上皮钠离子通道(αENaC)、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达水平。结果与假手术组相比,模型组死亡、呼吸急促、喘息及肺泡损伤严重,FVC、Cdyn、sirt1阳性表达水平、p-FOXO1+SPC+表达水平、αENaC蛋白表达明显降低,R、Th17/Treg、儿茶酚胺水平、肺湿重/干重、肺泡灌洗液淋巴细胞和巨噬细胞数量、IL-6、TNF-α蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,大黄素组无死亡,呼吸急促、喘息及肺泡损伤缓解,FVC、Cdyn、sirt1阳性表达水平、p-FOXO1+SPC+表达水平、αENaC蛋白表达明显升高,R、Th17/Treg、儿茶酚胺水平、肺湿重/干重、肺泡灌洗液淋巴细胞和巨噬细胞数量、IL-6、TNF-α蛋白表达明显降低(P<0.05),而NA组大鼠死亡增加,呼吸急促、喘息及肺泡损伤进一步加重,FVC、Cdyn、sirt1阳性表达水平、p-FOXO1+SPC+表达水平、αENaC蛋白表达明显降低,R、Th17/Treg、儿茶酚胺水平、肺湿重/干重、肺泡灌洗液淋巴细胞和巨噬细胞数量、IL-6、TNF-α蛋白表达明显升高(P<0.05);与大黄素组比较,大黄素+NA组FVC、Cdyn、sirt1阳性表达水平、p-FOXO1+SPC+表达水平、αENaC蛋白表达明显降低,R、Th17/Treg、儿茶酚胺水平、肺湿重/干重、肺泡灌洗液淋巴细胞和巨噬细胞数量、IL-6、TNF-α蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论大黄素可能通过激活sirt1/FOXO1通路,改善SAP大鼠肺损伤。

阿魏酸钠通过SIRT1/FOXO3A改善血管性痴呆大鼠学习记忆障碍的机制研究

目的探究阿魏酸钠在血管性痴呆(vascular dementia,VD)大鼠中的神经保护作用及其对前额叶皮质沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SRIT1)和叉头框转录因子O3A(forkhead box transcription factor O3A,FOXO3A)表达的影响。方法将32只雄性SD大鼠随机分成4组,每组8只。模型组和阿魏酸钠组大鼠行双侧颈总动脉栓塞;假手术组进行相同的手术操作,但不做结扎处理;正常组不做处理。阿魏酸钠组连续4周灌胃阿魏酸钠溶液(100 mg/kg),其余3组接受相同体积的生理盐水灌胃。通过Morris水迷宫、尼氏染色、Western Blot和免疫组织化学染色法观察比较各组大鼠行为学、细胞形态及SIRT1和FOXO3A蛋白的表达情况。结果正常组和假手术组神经元呈现较完整的形态结构。相较于正常组,模型组大鼠逃避潜伏期显著延长、穿越平台次数明显减少(P<0.05),细胞核固缩,SIRT1表达水平显著下降(P<0.05),FOXO3A表达显著上升(P<0.05);与模型组相比,阿魏酸钠组细胞形态得以改善,逃避潜伏期和FOXO3A蛋白表达均降低(P<0.05),穿台次数和SIRT1蛋白表达水平均升高(P<0.05)。结论阿魏酸钠通过调节SIRT1/FOXO3A改善大鼠学习记忆能力,为VD治疗提供了一定的研究基础。

疏肝平喘方通过转化生长因子-β_(1)/Smad信号通路对哮喘小鼠免疫平衡的影响

目的:阐明疏肝平喘方对哮喘小鼠维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)/叉头框蛋白P3(Foxp3)以及辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)平衡的干预作用,对转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))/Smad信号通路的影响。方法:建立空白对照组、哮喘模型组、疏肝平喘组及地塞米松组实验动物模型。酶联免疫吸附试验检测肺组织匀浆中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17A(IL-17A)和TGF-β_(1)水平,流式细胞仪检测肺组织中Th17/Treg细胞量,蛋白质印迹法检测肺组织中RORγt、Foxp3的蛋白表达,以及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织TGF-β_(1)、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表达水平。结果:疏肝平喘方能够降低哮喘小鼠肺组织IL-6、TGF-β_(1),与地塞米松比较,差异均有统计学意义(均P<0.05),调节IL-10、IL-17A,与地塞米松组相当(均P>0.05);Th17/Treg细胞量,RORγt、Foxp3的蛋白表达量,与地塞米松相当(均P>0.05)。与哮喘模型组比较,疏肝平喘方组、地塞米松组的TGF-β_(1)、Smad2、Smad3的mRNA表达水平下降,而Smad7的mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:疏肝平喘方在改善气道炎症方面,和地塞米松疗效相当,是通过TGF-β_(1)/Smad信号通路,从而调节哮喘小鼠的Th17/Treg免疫平衡。

电针对APP/PS1小鼠学习记忆及海马SIRT1、FOXO3A蛋白表达的影响

目的 观察电针对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型小鼠学习记忆能力、海马区神经元形态及沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)、叉头框转录因子O3A(forkhead box transcription factor O3A,FOXO3A)表达的影响,探讨电针治疗AD的作用机制。方法30只6月龄雄性淀粉样前体蛋白/早老蛋白1(amyloid precursor protein/presenilin-1,APP/PS1)双转基因小鼠随机分成模型组、电针组、电针+抑制剂组,每组10只。以同源背景C57BL/6野生鼠10只作为空白对照组。除电针+抑制剂组,其余三组在干预前30分钟腹腔注射磷酸盐缓冲液。空白对照组与模型组仅予以束缚,电针组在针刺“百会”“印堂”“水沟”穴的基础上加用脉冲电流,电针+抑制剂组在电针组基础上于干预前腹腔注射3-甲基腺嘌呤溶液。各组干预20分钟/次,每日一次,共15天。15天治疗结束后通过Morris水迷宫实验观察四组小鼠行为学改变;采用苏木素—伊红染色观察各组海马区细胞形态;分别采用免疫组化和蛋白免疫印迹法观察各组小鼠海马组织SIRT1、FOXO3A的表达情况。结果 (1) Morris水迷宫结果显示:电针组较模型组逃避潜伏期明显缩短、穿越站台次数及Ⅰ象限运动距离百分比明显增多(P <0.05,P <0.01);(2)苏木素—伊红染色结果显示:较之模型组,电针组、电针+抑制剂组可不同程度改善海马区神经元病理特征;(3)免疫组化结果显示:较之模型组,电针组SIRT1表达明显上调,总FOXO3A表达下降(P <0.01),电针+抑制剂组SIRT1表达增高(P <0.01);(4)蛋白免疫印迹结果显示:较之模型组,电针组SIRT1、胞核FOXO3A蛋白表达明显上调,胞质FOXO3A蛋白表达明显下调(P <0.01),电针+抑制剂组SIRT1、胞核FOXO3A蛋白表达稍增多(P <0.05),胞质FOXO3A蛋白表达减少(P <0.01)。结论“通督启神”法电针可提高AD小鼠空间学习记忆能力和改善海马区神经元形态结构,其机制可能与增强AD小鼠海马区SIRT1蛋白表达,提高FOXO3A的转录活性有关。

宣白承气汤调控sirt1/FOXO1通路对脂多糖致大鼠急性肺损伤的影响

目的:探讨宣白承气汤对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤大鼠的影响以及可能机制。方法:清洁级SD雄性大鼠50只,尾静脉注射LPS制备急性肺损伤模型,随机分为模型组、阳性对照组(地塞米松)、低剂量宣白承气汤组(2g生药/kg)、中剂量宣白承气汤组(5g生药/kg)、高剂量宣白承气汤组(8g生药/kg),每组10只,另设正常对照组10只,模型制备成功后连续7d给药,末次给药后通过HE染色法观察肺组织病理变化,通过考马斯亮蓝法检测大鼠肺泡灌洗液蛋白含量,通过酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)水平,采用免疫印迹法(WB)检测大鼠肺组织sirt1/FOXO1通路相关蛋白表达。结果:模型组大鼠肺泡腔内充满炎性渗出物和出血,低、中、高宣白承气汤组炎症细胞浸润及出血情况有所改善;与正常组相比,模型组大鼠肺泡灌洗液蛋白、肺体指数、血清TNF-α、NO水平、大鼠肺组织FOXO1蛋白水平显著升高(P<0.05),大鼠肺组织sirt1蛋白水平显著下降(P<0.05);与模型组相比,低、中、高剂量宣白承气汤组肺泡灌洗液蛋白、肺体指数、血清TNF-α、NO水平、大鼠肺组织FOXO1蛋白水平均依次降低(P均<0.05),大鼠肺组织sirt1蛋白水平依次升高(P<0.05),且高剂量宣白承气汤组肺泡灌洗液蛋白、肺体指数、血清TNF-α、NO水平、大鼠肺组织FOXO1、sirt1蛋白水平与阳性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:宣白承气汤可能通过激活sirt1表达抑制FOXO1转录,进而降低炎症反应,减轻LPS诱导的大鼠急性肺损伤。