硫化氢通过调控沉默信息调节子1抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤

目的观察外源性硫化氢(H2S)对高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化应激损伤的保护作用及其可能机制。方法用25 mmol/L D-葡萄糖(高糖)、外源性H2S供体硫化氢钠(NaHS)(5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L)及沉默信息调节子1(SIRT1)特异性抑制剂尼克酰胺(40 mmol/L)处理HUVECs细胞株24 h。实验分为对照组、高糖组、甘露醇组、NaHS(5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3、5×10-3mol/L)组、高糖+NaHS(5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L)组和高糖+NaHS(10-3 mol/L)+尼克酰胺组。采用MTT比色法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞内的内活性氧(ROS)水平,Western bolt法检测SIRT1的表达。结果与对照组比较,高糖组细胞活力显著降低[OD值分别为(0.76±0.09)和(0.18±0.01),t=5.34,P<0.05],细胞内ROS水平显著增加[ROS水平分别为(356.18±42.96)au和(1183.63±84.31)au,t=6.72,P<0.05]。与高糖组比较,高糖+NaHS(5×10-4、1×10-3和5×10-3 mol/L)组细胞活力显著增加[OD值分别为(0.18±0.01)、(0.39±0.05)、(0.68±0.04)和(0.51±0.08),t1=3.16,t2=3.95,t3=3.86,均P<0.05],细胞内ROS水平显著降低[ROS水平分别为(1183.63±84.31)、(874.32±85.36)、(628.65±54.27)和(439.56±53.64)au,t1=3.46,t2=3.97,t3=5.13,均P<0.05]。与对照组比较,高糖组细胞中SIRT1蛋白表达显著下调[蛋白相对表达量分别为(0.48±0.04)和(0.17±0.03),t=3.94,P<0.05]。与高糖组比较,高糖+NaHS(10-3mol/L)组细胞中SIRT1表达显著上调[蛋白相对表达量分别为(0.17±0.03)和(0.59±0.08),t=4.36,P<0.05]。SIRT1抑制剂尼克酰胺取消了NaHS抑制高糖诱导的HUVECs细胞活力的降低[高糖+NaHS组和高糖+NaHS+尼克酰胺组OD值分别为(0.52±0.04)和(0.23±0.03),t=2.98,P<0.05]和细胞内ROS水平的增加[高糖+NaHS组和高糖+NaHS+尼克酰胺组ROS水平分别为(628.65±54.27)au和(1052.84±113.42)au,t=3.76,P<0.05]。结论外源性H2S抑制了高糖诱导的HUVECs氧化应激损伤,其机制可能与H2S上调SIRT1的表达有关。

白藜芦醇激活沉默信息调节子1抑制NLRP3炎症小体对脓毒症肠道黏膜屏障功能损伤的研究

目的探讨白藜芦醇(RSV)能否通过激活沉默信息调节子1(SIRT1)调控NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体活化,进而改善脓毒症肠道炎症反应及细胞凋亡,从而发挥肠道屏障功能保护作用。方法①体外实验:培养人结直肠腺癌细胞(Caco-2),并分为正常组(完全培养基培养48 h),脂多糖(LPS)组(完全培养基培养24 h后加入2 mg/L的LPS处理12 h),RSV低、中、高浓度组及SIRT1抑制剂(EX-527)组(完全培养基培养24 h后加入2 mg/L的LPS处理6 h,随后再分别加入RSV 10、20、40μmol/L或EX-52710μmol/L处理6 h)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-18、IL-1β)等炎性因子水平;用流式细胞仪检测细胞凋亡水平;用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测NLRP3、SIRT1、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)及凋亡相关点样蛋白(ASC)的蛋白表达。②体内实验:将24只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为假手术(Sham)组、盲肠结扎穿孔术(CLP)6 h组、CLP 24 h组及RSV干预组(CLP术后6 h、12 h腹腔注射RSV 20 mg/kg),每组6只。采用免疫组化法检测大鼠肠道中NLRP3、caspase-1及ASC表达情况。结果①与正常组比较,经LPS处理后细胞上清液中炎性因子水平升高,SIRT1蛋白表达降低,NLRP3、caspase-1及ASC蛋白表达升高。与LPS组相比,不同浓度RSV可降低炎性因子水平,增加SIRT1活性,抑制NLRP3炎症小体下游产物caspase-1、ASC的表达,其中40μmol/L高浓度RSV作用最为明显〔TNF-α(ng/L):8.77±0.43比12.66±0.81,IL-6(ng/L):1.35±0.20比1.93±0.09,IL-1β(ng/L):1.05±0.04比1.31±0.07,IL-18(ng/L):519.50±11.16比622.70±30.69,SIRT1/β-actin:0.80±0.05比0.58±0.02,caspase-1/β-actin:0.55±0.06比0.78±0.06,ASC/β-actin:0.78±0.08比1.04±0.15,均P<0.05〕,而SIRT1抑制剂EX-527的作用则相反。正常组、LPS组及RSV低、中、高浓度组和EX-527组间细胞凋亡率差异并无统计学意义〔(7.03±0.57)%、(9.67±0.55)%、(9.57±0.70)%、(9.30±2.15)%、(9.87±0.97)%、(9.07±0.93)%,F=2.590,P=0.082〕。②免疫组化结果显示,相比Sham组,CLP 6 h组、CLP 24 h组及RSV干预组大鼠肠道上皮细胞中NLRP3炎症小体及下游产物caspase-1、ASC表达增加。而RSV干预组肠道上皮中ASC表达的阳性面积所占百分比较CLP 6 h组显著减少〔(15.22±2.73)%比(19.88±2.67)%,P<0.05〕,NLRP3及caspase-1表达的阳性面积所占百分比较CLP 24 h组显著减少〔(9.31±1.37)%比(13.19±1.92)%,(19.57±3.92)%比(27.28±6.33)%,均P<0.05〕。结论在体内及体外脓毒症肠道损伤模型中,高浓度RSV可通过激活SIRT1抑制NLRP3炎症小体活化,进而降低下游caspase-1及ASC的表达,发挥抑制炎性因子分泌减轻炎症反应的作用。

Exendin-4通过调控SIRT1/P53信号通路改善高糖作用下的内皮祖细胞功能障碍

目的研究Exendin-4对高糖诱导的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)功能障碍的影响,并探讨沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)蛋白在其中的作用。方法采用密度梯度离心法分离并培养健康志愿者外周血EPCs,将不同浓度Exendin-4(12.5、50、100、200μmol·L-1)联合高糖(25 mmol·L-1)处理EPCs并检测其活力,选择药物的最佳作用浓度。将最佳浓度的Exendin-4与高糖共处理EPCs 72 h后检测其功能活性。通过迁移、黏附、小管形成实验检测EPCs功能;同时对乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平进行检测。使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA的表达。使用Western blot来检测SIRT1、p53和Ac-p53的蛋白表达。结果Exendin-4处理可明显改善高糖作用下EPCs的活力,尤以50μmol·L-1时作用效果最佳(P<0.05)。与高糖组相比,Exendin-4处理可上调SIRT1蛋白表达(P<0.05),增加高糖作用下EPCs的体外迁移、黏附、小管形成能力(P<0.05),并改善LDH及MDA水平(P<0.05),同时抑制TNF-α、IL-β及IL-6的mRNA表达(P<0.05)。而SIRT1受体抑制剂(EX-527)可使Exendin-4改善EPCs功能活性的作用受到明显的抑制(P<0.05)。另外,使用SIRT1激动剂(SRT1720)亦可改善高糖诱导的EPCs功能障碍(P<0.05)。结论Exendin-4可提高高糖作用下EPCs活力,改善EPCs功能,抑制氧化应激损伤,降低炎症因子表达,其机制可能与调控SIRT1/p53信号通路有关。

白藜芦醇通过失活FoxO1及激活Sirt1在IL-1β处理的SW1353细胞中发挥抗骨关节炎效应

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)抑制白介素1β(interleukin 1β,IL-1β)处理的SW1353细胞的炎症反应与叉头框转录因子O1(forkhead transcription factors O1,FoxO1)/细胞沉默信息调节子1(silent information regulator 1,Sirt1)信号之间的关系。方法采用SW1353软骨肉瘤细胞系,进行如下4个方面的处理及检测:给予10ng/ml IL-1β的同时,加入RES(12.5、50μmol/L)处理24 h,Western blot法检测Sirt1蛋白的表达;给予10ng/mL IL-1β的同时,加入RES(50μmol/L)处理30 min,免疫细胞化学技术检测FoxO1的定位,Western blot法检测FoxO1及p-FoxO1水平;FoxO1 siRNA进行转染,荧光显微镜下观察转染效率,Western blot法检测FoxO1的抑制效果及对Sirt1的影响;FoxO1siRNA转染后,Western blot法检测RES处理对Sirt1蛋白表达的影响,ELISA法检测细胞培养基上清IL-6的水平。结果单纯IL-1β处理对Sirt1的蛋白表达无明显影响,而给予RES(12.5、50μmol/L)处理后显著增加Sirt1水平。加入IL-1β/RES后,FoxO1主要定位于细胞质中;IL-1β处理显著上调p-FoxO1水平,而加入RES则进一步增加p-FoxO1水平;FoxO1水平保持不变。FoxO1基因沉默可有效抑制细胞FoxO1水平,同时Sirt1水平也被显著抑制。FoxO1基因沉默后抑制RES诱导的Sirt1水平,抑制IL-1β增加的IL-6水平,而RES处理则引起IL-6水平的进一步降低。结论在IL-1β处理的SW1353细胞中,RES可以通过失活FoxO1,增加Sirt1的水平发挥抗炎效应。

白藜芦醇通过促进SIRT1表达,抑制NF-κB和TNF-α表达抵抗牛磺胆酸诱导的胎盘合体滋养细胞HTR-8的炎症损伤

已有研究证明,沉默信息调节子1(silent information regulator 1,SIRT1)和核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)参与多种炎性反应调节;SIRT1激活剂——白藜芦醇(resveratrol)可通过依赖或不依赖于SIRT1的途径抑制炎症反应。然而,SIRT1及白藜芦醇在妊娠期肝内胆汁瘀积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)炎性反应中的作用在国内外尚未见报道。本研究证明,白藜芦醇可通过上调SIRT1表达,下调NF-κB及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)表达保护牛磺胆酸(taurocholic acid,TCA)引起的胎盘合体滋养细胞HTR-8炎性损伤。免疫组化及Western印迹显示,SIRT1蛋白在正常胎盘组织的表达水平明显高于妊娠期ICP胎盘组织,而NF-κB蛋白表达在正常胎盘组织的表达低于ICP胎盘组织。Western印迹揭示,SIRT1蛋白在HTR-8细胞中的表达水平随暴露的TCA浓度增高而降低;相反,NF-κB和TNF-α蛋白质水平随TCA浓度增高而升高。采用白藜芦醇处理HTR-8细胞,该差异可被逆转;且白藜芦醇这一作用可被Ex-527(一种SIRT1抑制剂)阻断。上述结果证明,在ICP胎盘合体滋养细胞炎性反应中SIRT1表达下调,而NF-κB表达上调;其可能的机制是ICP高浓度胆汁酸干扰胎盘合体滋养细胞SIRT1-NF-κB通路,诱导炎症反应。上述结果还提示,SIRT1激动剂白藜芦醇可通过诱导SIRT1表达,抑制NF-κB及TNF-α表达,保护牛磺胆酸诱导的胎盘合体滋养细胞的炎性损伤。本研究为白藜芦醇临床治疗(妊娠期)肝内胆汁瘀积症提供了新的证据。至于白藜芦醇是否可直接抑制NF-κB的表达还有待进一步探讨。

SIRT1调控Nrf2/HO-1信号通路对脓毒症诱导的急性肺损伤的影响

目的:探讨沉默信息调节子1(SIRT1)能否调控核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路,以及在脓毒症大鼠急性肺损伤(ALI)中的作用。方法:将24只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症模型组(CLP组)、脓毒症+SIRT1特异性激动剂组(CLP+SRT1720组,术前2 h腹腔注射SRT1720 10 mg/kg)、脓毒症+SIRT1特异性抑制剂组(CLP+EX527组,术前2 h腹腔注射EX527 10 mg/kg),每组6只。制模后24 h处死大鼠取肺组织,并进行肺组织病理评分(Smith评分),检测肺组织超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-1β)以及SIRT1、Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达。结果:与Sham组相比,CLP组肺泡结构受损、肺泡间隔增宽、炎症细胞浸润、肺毛细血管充血,Smith评分显著升高;肺组织炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明显升高,SOD活性及GSH含量降低,MDA及8-OHdG含量升高;肺组织SIRT1、Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达降低。使用SIRT1特异性激动剂后,CLP+SRT1720组较CLP组肺组织损伤得到明显缓解,Smith评分及肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显下降〔Smith评分(分):2.83±0.75比5.67±0.52,TNF-α(ng/L):36.78±5.36比66.99±5.44,IL-6(ng/L):23.97±3.76比45.70±4.16,IL-1β(ng/L):16.76±1.39比39.64±2.59,均 P<0.05〕,SOD活性及GSH含量升高〔SOD(kU/g):115.88±3.31比101.65±1.09,GSH(μmol/g):8.42±0.81比5.74±0.46,均 P<0.05〕,MDA及8-OHdG含量降低〔MDA(μmol/g):5.24±0.33比9.86±0.66,8-OHdG(ng/L):405.76±8.54比647.12±10.64,均 P<0.05〕,肺组织SIRT1、Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达明显升高〔SIRT1 mRNA(2^(-ΔΔCT)):1.49±0.15比0.64±0.03,Nrf2 mRNA(2 -ΔΔCT):1.19±0.08比0.84±0.02,HO-1 mRNA(2^(-ΔΔCT)):1.80±0.41比0.64±0.11,SIRT1蛋白(SIRT1/β-actin):1.03±0.06比0.52±0.05,Nrf2蛋白(Nrf2/β-actin):1.14±0.10比0.63±0.05,HO-1蛋白(HO-1/β-actin):1.01±0.11比0.73±0.03,均 P<0.05〕。而使用SIRT1特异性抑制剂后,CLP+EX527组较CLP组肺组织损伤明显加重,Smith评分及肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显升高〔Smith评分(分):8.00±0.89比5.67±0.52,TNF-α(ng/L):87.15±4.23比66.99±5.44,IL-6(ng/L):66.79±2.93比45.70±4.16,IL-1β(ng/L):58.99±2.12比39.64±2.59,均 P<0.05〕,SOD活性及GSH含量降低〔SOD(kU/g):72.84±3.85比101.65±1.09,GSH(μmol/g):3.30±0.67比5.74±0.46,均 P<0.05〕,MDA及8-OHdG含量升高〔MDA(μmol/g):14.14±0.70比9.86±0.66,8-OHdG(ng/L):927.66±11.47比647.12±10.64,均 P<0.05〕,肺组织SIRT1、Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达明显降低〔SIRT1 mRNA(2^(-ΔΔCT)):0.40±0.07比0.64±0.03,Nrf2 mRNA(2^(-ΔΔCT)):0.48±0.07比0.84±0.02,HO-1 mRNA(2^(-ΔΔCT)):0.27±0.14比0.64±0.11,SIRT1蛋白(SIRT1/β-actin):0.20±0.05比0.52±0.05,Nrf2蛋白(Nrf2/β-actin):0.45±0.01比0.63±0.05,HO-1蛋白(HO-1/β-actin):0.36±0.08比0.73±0.03,均 P<0.05〕。 结论:在脓毒症ALI大鼠模型中,可通过激活SIRT1调控Nrf2/HO-1信号通路活化,上调下游抗氧化酶的表达,减少氧化应激损伤,进而减轻脓毒症诱导的ALI。

靶向调控SIRT1基因表达对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响及其机制研究

目的靶向调控沉默信息调节子1(SIRT1)基因表达对子宫内膜癌(EC)细胞生物学行为的影响及其机制。方法构建慢病毒介导的SIRT1基因小发夹RNA(shRNA),慢病毒感染EC细胞株并验证SIRT1基因沉默效果;检测RL95-2细胞的生物学行为及p53、p21蛋白表达。结果 shSIRT1-1组、shSIRT1-2组SIRT1 mRNA、SIRT蛋白表达显著低于shControl。shSIRT1-1组、shSIRT1-2组RL95-2细胞出现明显生长抑制,shSIRT1-1组、shSIRT1-2组细胞凋亡率显著高于shControl组;shSIRT1-1组、shSIRT1-2组中细胞克隆直径> 10 mm的细胞数、迁移细胞数、侵袭细胞数显著低于shControl组;shSIRT1-1组、shSIRT1-2组p53、p21蛋白相对表达量均显著高于shControl组。结论慢病毒介导的RNA干扰技术靶向沉默SIRT1基因可能通过p53/p21途径抑制RL95-2细胞增殖、非锚定依赖性、迁移及侵袭,促进RL95-2细胞凋亡。

输血对脓毒症大鼠急性肺损伤肺上皮细胞活性、肺超微结构及SIRT1/PGC-1α的影响

目的探讨输血对脓毒症大鼠急性肺损伤肺上皮细胞活性、肺超微结构及沉默信息调节子1(SIRT1)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)蛋白表达的影响。方法从50只SPF级SD雄性大鼠中选取35只建模,建模成功后随机选取30只,分为模型(B)组,液体复苏(C)组,输血(D)组,每组10只;从剩余的15只中随机选取10只作为正常对照(A组)。对C组实施液体复苏治疗,对D组实施输血治疗,A组、B组不给药,记录肺系数并用干湿重法测定肺含水量(LWC),HE染色法检测肺组织病理形态,电子显微镜观察肺超微结构,TUNEL法检测肺上皮细胞活性,免疫印迹法检测大鼠肺组织中SIRT1/PGC-1α蛋白表达。结果与A组比较,B组肺系数、LWC、肺上皮细胞凋亡率明显升高(P<0.05),肺组织SIRT1/PGC-1α蛋白表达显著降低(P<0.05),与B组比较,C组、D组的肺系数、LWC、肺上皮细胞凋亡率明显降低(P<0.05),肺组织SIRT1/PGC-1α蛋白表达显著升高(P<0.05),且D组比C组变化明显(P<0.05);A组肺组织结构清晰完整,未见明显病理改变,B组可见明显病理改变,与B组比较,C组、D组病理症状明显改善,且D组改善更为明显;A组肺组织超微结构正常,B组肺组织超微结构出现明显异常,与B组相比,C组、D组肺组织超微结构明显改善,且D组改善最为明显。结论输血对脓毒症大鼠有很好的疗效,可显著改善肺损伤、肺上皮细胞活性及肺超微结构,并促进SIRT1/PGC-1α蛋白表达。

护卵汤对早发性卵巢功能不全模型小鼠SIRT1/NF-κB/p53/p21通路的影响

目的:观察护卵汤对雷公藤多苷诱导早发性卵巢功能不全模型小鼠卵巢组织中凋亡相关蛋白沉默信息调节子1(SIRT1),肿瘤抑制基因p53,乙酰化p53(Ac-p53),细胞周期蛋白依赖性抑制剂p21,核转录因子-κB(NF-κB)p65表达情况及组织结构变化。方法:50只雌性C57BL/6J小鼠随机分正常组、模型组、护卵汤低、高剂量组、戊酸雌二醇组,采用雷公藤多苷80 mg·kg^(-1)·d^(-1)连续灌胃,第15天给予护卵汤低、高剂量组1.6,6.2 g·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,戊酸雌二醇组给予戊酸雌二醇0.13 mg·kg^(-1)·d^(-1),连续21 d,正常组予等量蒸馏水。末次给药后取血和卵巢,苏木素-伊红(HE)染色观察组织形态学变化,ELISA检测血清中抗苗勒激素(AMH),促卵泡激素(FSH),黄体生成素(LH)水平含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)法检测p53,p21 mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测SIRT1,p53,p21,Ac-p53,NF-κB蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠动情周期紊乱,卵巢体积减小,各级卵泡数明显减少,AMH含量降低,FSH,LH含量升高,p53,p21 mRNA表达显著升高,p53,p21,Ac-p53,NF-κB蛋白表达显著升高,SIRT1蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,护卵汤高剂量组卵泡增多,AMH升高,FSH,LH降低,SIRT1蛋白表达升高(P<0.01),p53,p21 mRNA表达水平显著下调(P<0.01),p53,p21,Ac-p53,NF-κB蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论:护卵汤的治疗可明显扭转衰老进程,其改善卵巢功能的机制可能与提高了卵巢细胞中SIRT1/NF-κB/p53/p21通路活性,改变细胞凋亡状态相关,从而增加了生长卵泡及成熟卵泡含量,降低了闭锁卵泡的含量。