利用基因沉默技术验证东方百合‘Justina’番茄红素β-环化酶基因的功能

【目的】研究调控东方百合叶色的类胡萝卜素代谢途径关键酶番茄红素β-环化酶基因功能。【方法】利用基因沉默技术(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)构建烟草脆裂病毒与东方百合番茄红素β-环化酶基因的重组载体,采用切割侵染法侵染东方百合‘Justina’植株叶片,分析对照组、烟草脆裂病毒空载体侵染组和携带有番茄红素β-环化酶基因的重组烟草脆裂病毒载体侵染组这些组中东方百合叶片的各种色素含量和番茄红素β-环化酶基因表达量变化。【结果】对照组叶片和空载体侵染组叶片未有明显的白化或黄化现象,重组载体侵染组叶片在刀口边缘出现明显黄化现象,番茄红素β-环化酶基因的表达量及类胡萝卜素含量均明显低于对照组。【结论】番茄红素β-环化酶基因沉默导致东方百合‘Justina’叶片的黄化,抑制类胡萝卜素的合成,表明番茄红素β-环化酶在东方百合‘Justina’叶片类胡萝卜素合成调控中起着重要作用。

利用基因沉默技术治疗艾滋病的新进展

美国南加州大学Cannon领导的研究小组在《自然-生物技术》（NatureBiotechnology）杂志上发表了有关利用基因技术治疗艾滋病的新的研究成果。

Tekmira／BMS合作研究基因沉默技术

Tekmira制药公司与Bristol—Myers Squibb公司在一项新技术上合作，该技术将小的干扰RNA（siRNAs）导入肝脏外的特异的器官和组织。

烟草上基因沉默技术的应用分析

基因沉默技术即virus—induced genetic silencing,简称VIGS,指的是带有目的基因的病毒在入侵对象植物内部后,诱导植物内部相同序列基因不进行表达的操作,其属于转录后水平基因沉默现象。因基因沉默技术本身的应用优势,烟草行业相关技术人员在发展过程中,开始有意识地将其应用在烟草抗病育种与基因功能探索方面,并取得了较好的效果。本文就基因沉默技术的应用局限性、烟草上基因沉默技术的应用途径及前景进行了论述与分析。

科学家利用基因沉默技术开发抗CMV土豆品种

日本千叶大学的科学家及其同事称他们利用基因沉默技术,成功地开发出了绝对抗黄瓜花叶病毒(CMV)特定毒株的转基因土豆。该团队研究了对CMV敏感的栽培品种'Danshaku'的两种结构,均包含一个编码有缺陷的CMV酶的基因片段。用它们来生产遗传工程马铃薯品系。

病毒诱导的基因沉默技术用于植物色素代谢机制的研究进展

色彩是评价园艺植物观赏性状的重要指标,而植物色素是影响植物色彩表型的关键因子。植物色素及其代谢产物在植物观赏器官颜色形成、植株生长发育调节及对逆境胁迫的响应等方面发挥着重要的作用,是植物研究领域长期关注的热点问题。病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是利用植物同源依赖性防御机制,特异性降低宿主内源性基因表达的一种重要基因组学工具,能够通过快速诱导植物基因沉默表型的产生,表征基因的功能,为缺乏遗传转化体系的植物的基因功能鉴定提供高效可行的替代方案。本文综述了VIGS技术在植物色素的生物合成、降解和调控机制上的应用现状,并探讨了VIGS技术在探究色素调控机制上的潜力和未来前景,以期进一步完善对不同植物色素的代谢过程和调控机制的理解,为改良植物色彩性状提供参考依据。

siRNA沉默Drp1对鱼藤酮诱导的帕金森病模型细胞自噬和凋亡的影响

目的探究siRNA沉默动力相关蛋白1(Drp1)后对鱼藤酮诱导的帕金森病模型细胞自噬以及细胞凋亡的影响。方法体外培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,用1μm、5μm、10μm、20μm鱼藤酮进行处理24 h、48 h,MTT法检测细胞抑制情况。将细胞分为鱼藤酮最佳浓度处理组(20μm鱼藤酮处理,损伤组)、阴性转染组(损伤组基础上转染Drp1阴性序列)、Drp1siRNA处理组(损伤组基础上转染Drp1 siRNA)、Drp1抑制剂组(损伤组基础上添加Mdivi-1试剂)、自噬促进剂组(损伤组基础上添加雷帕霉素)。观察各组线粒体自噬情况、细胞线粒体功能相关蛋白(Mfn2、Drp1、NRF1)、自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3、P62)、凋亡蛋白(Bcl-2、Bax)表达情况和细胞凋亡情况。结果与对照组相比,鱼藤酮处理组细胞抑制率均升高,随着浓度以及培养时间的增加,细胞抑制率逐渐增加(P<0.05)。损伤组、阴性转染组、自噬促进剂组LC3II定位在细胞线粒体,且细胞线粒体结构受损,外周出现自噬双层膜。与Drp1 siRNA转染组、Drp1抑制剂组相比,损伤组、阴性转染组、自噬促进剂组Drp1、LC3II、Beclin-1、Bax蛋白表达和细胞凋亡率升高,Mfn2、NRF1、P62、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。结论 Drp1参与鱼藤酮诱导帕金森病细胞线粒体自噬,沉默Drp1后可降低鱼藤酮诱导帕金森病细胞线粒体自噬以及细胞凋亡,具有保护作用。

Survivin基因沉默对结直肠癌细胞增殖、迁移能力的影响

目的观察结直肠癌细胞中Survivin的表达情况,及Survivin基因沉默对结直肠癌细胞增殖、迁移能力的影响。方法培养正常结肠上皮细胞系NCM460及结直肠癌细胞株SW480,将SW480细胞分为实验组和对照组(留取部分细胞待测Survivin mRNA及蛋白),实验组转染Survivin siRNA,对照组转染control siRNA。检测NCM460细胞、SW480细胞、实验组及对照组细胞中的Survivin mRNA及蛋白;实验组及对照组转染48 h后,采用MTT实验检测两组细胞增殖能力,Transwell实验和划痕实验检测细胞迁移能力。结果 NCM460细胞中Survivin mRNA、蛋白相对表达量分别为0.16±0.10、0.20±0.15,SW480细胞中Survivin mRNA、蛋白相对表达量分别为1.00±0.00、1.00±0.00,二者相比,P均<0.05。转染48 h后,实验组细胞中Survivin mRNA、蛋白相对表达量分别为0.20±0.13、0.31±0.12,对照组细胞中Survivin mRNA、蛋白相对表达量分别为1.00±0.00、1.00±0.00,两组相比,P均<0.05。两组转染48 h后,继续培养12、24、48、72 h实验组细胞增殖能力低于对照组(P均<0.05)。实验组每视野穿膜细胞数为(140±15)个,对照组为(27±6)个,两组相比,P<0.05。结论 Survivin基因沉默可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移能力。

RNAi沉默原代星形胶质细胞IL-17基因表达方法的建立

目的通过基因沉默技术构建质粒成功转染原代星形胶质细胞(Ast)抑制IL-17表达,探讨IL-17的功能。方法在制备原代Ast基础上,应用IL-17基因沉默质粒pGenesil-1A和B,用Lipofectamine 2000转染Ast,通过荧光分析法、RT-PCR法、Western Blotting法观察IL-17基因沉默后效果。结果携带pGenesil-1B和A的IL-17基因沉默质粒制备成功后,免疫荧光携带pGenesil-1B转染效果明显高于pGenesil-1A,其转染率可高达56.72%;基因沉默组在转染后72 h内任一时间点IL-17 mRNA表达均低于正常对照组和基因沉默对照组(P<0.05),且24 h IL-17表达最低(P<0.05)。蛋白表达上,在IL-17基因沉默后3、5、7 d,其蛋白表达仍持续减低(P<0.05)。结论应用Lipofectamine 2000可成功将IL-17 RNAi pGenesil-1质粒转染至原代星形胶质细胞。

RNA干扰技术的成就和困惑

2008年3月26日在线发表于Nature的2项研究阐述了目前基因沉默技术获得的成功和存在的问题。以丹麦Santaris Pharma生物制药公司的Sakari Kauppinen为首的研究小组在非洲绿猴体内成功地运用基因治疗技术关闭小量RNA的表达，为治疗恶性肿瘤及心血管疾病提供了新的途径；但美国肯塔基大学Jayakrishna Ambati领导的关于RNA干扰（RNAi）的研究结果表明，尚未深入了解RNAi的机制之前，建议在人体试验中谨慎使用这项技术。

浅谈心理辅导活动过程中的沉默

沉默技术是指咨询过程中，因为某些因素，当事人因无法继续所谈的内容而沉默，咨询员因为知道某些重要的信息正在当事人的内心运转而允许当事人沉默，让谈话暂时停顿，并且在当事人沉默之后，询问当事人沉默时发生的事。

病毒诱导的全新tae-miR9663的沉默影响叶片发育和籽粒大小

MicroRNA(miRNA)是一类长度为18~24nt的非编码小分子RNA,参与植物各种发育进程。tae-miR9663是新发现的在小麦幼苗、旗叶和籽粒中高表达的miRNA,但其生物学功能未知。为了探索taemiR9663的功能,通过人工合成tae-miR9663的小串联模拟靶标(short tandem target mimic,STTM),将其构建到大麦条斑花叶病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)载体上,利用病毒介导的基因沉默(virus-inducing gene silencing,VIGS)技术转染小麦宁春16五叶一心期的第5片叶,转染20d后观察叶片表型并取旗叶进行实时定量PCR,成熟时观察种子大小。叶片表型观察结果表明,与BSMV:00相比,接种BSMV:STTM-taemiR9663的9株幼苗中出现4种叶片表型,即第6片叶有白点或白条纹,旗叶(第7片叶)有白点或白条纹,第6片叶边缘有锯齿状,旗叶叶尖处有皱缩。实时定量PCR分析结果表明,STTM-tae-miR9663过表达植株的tae-miR9663表达丰度下降,说明BSMV-VIGS技术可通过过表达STTM有效地沉默内源miRNA。成熟种子大小观察结果表明,与BSMV:00比较,接种BSMV:STTM-tae-miR9663的植株种子的长和宽均减小。

瞬时沉默乙醛脱氢酶对辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能的影响

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)产生的效应因子RxLR129113在本氏烟上的功能之一是抑制BAX引起的细胞坏死,而且已经证实乙醛脱氢酶(ALDH)是RxLR129113的互作蛋白。为了探究乙醛脱氢酶(ALDH)是否影响Rx LR129113抑制BAX引起的细胞坏死,本研究利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术,克隆了乙醛脱氢酶(ALDH)基因片段,插入到烟草脆裂病毒载体(TRV)中,构建了pTRV-ALDH的VIGS载体,转入农杆菌侵染本氏烟后qrt-PCR验证成功沉默了ALDH基因。在沉默ALDH基因的本氏烟上瞬时表达RxLR129113,24 h接种BAX。结果表明,在NbALDH沉默植株上,RxLR129113仍然抑制BAX引起的细胞坏死。本研究结果表明RxLR129113与ALDH互作不影响其抑制BAX引起的细胞坏死,为进一步深入开展辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能机制研究奠定了基础。

沉默囊泡分选蛋白(VPS)对辣椒疫霉效应因子Rx LR504功能的影响

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一种重要的病原卵菌,能产生大量的RxLR效应分子帮助病原菌定殖。前期实验证明RxLR504效应分子能够抑制INF1引发的细胞死亡,并证实囊泡分选蛋白(VPS)与其相互作用。本文借助VIGS tool在线工具设计靶标基因沉默片段;利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟靶标基因;提取沉默样品叶片组织RNA,构建c DNA文库;利用qRT-PCR检测靶标基因表达水平;在沉默植株叶片上表达RxLR504,24 h后接种INF1,观察病斑症状。结果表明:本氏烟中设计沉默片段长度为300 bp,构建c DNA文库质量较高;荧光定量PCR结果显示,沉默植株中靶标基因表达水平下降86.2%,与对照相比差异性显著;接种实验证明RxLR504在沉默植株与对照植株上均能抑制INF1引发的细胞死亡。RxLR504与VPS互作不影响其抑制INF1引起的细胞坏死,为进一步揭示病原物利用植物靶标基因抑制植物免疫从而促进自身寄生的机制打下基础。

瞬时受体电位通道C1在豚鼠哮喘气道重塑中的作用机制及布地奈德的干预作用

目的通过干预瞬时受体电位通道C1(TRPC1)的表达,探讨TRPC1离子通道在气道重塑演变过程中的作用机制及布地奈德的干预作用。方法雄性普通级豚鼠50只,随机均分为5组:A组为空白对照组、B组为卵蛋白刺激组、C组为卵蛋白刺激+TRPC1 siRNA干扰组、D组为卵蛋白刺激+荧光素酶siRNA干预组、E组为卵蛋白刺激+布地奈德干扰组。取肺泡灌洗液(BALF),比较嗜酸性粒细胞(Eos)占总细胞数的百分比;酶联免疫吸附法(ELISA)测定BALF中IL-5,IL-13表达水平。取支气管肺组织行苏木精-伊红染色(HE)、马松三色染色(Maason),Image-Pro图像处理软件定量分析支气管壁厚度、平滑肌增殖及胶原沉积情况。免疫组化法观察TRPC1蛋白在肺内相对表达水平。实时荧光定量PCR法测定TRPC1 m RNA的相对表达。结果Image-Pro图像软件分析结果示,B组显著表现出支气管壁增厚、平滑肌增殖、基底膜胶原沉积、气道周围炎症细胞浸润、炎症因子增加等病理变化,C组、E组的上述病理变化则不明显(P<0.05)。进一步行免疫组化法显示,TRPC1蛋白位于支气管上皮粘膜层,主要分布于支气管粘膜基底细胞、柱状上皮细胞的胞膜及胞核内。结论 TRPC1通道在哮喘个体的高水平表达与气道重塑、慢性气道炎症的发生、发展密切关联;而布地奈德可在一定程度上通过调节TRPC1的表达参与气道重塑的演变。

RNA干扰抗HBV的研究进展

RNA干扰目前已经成为生命科学领域中的一个热点。最近,一系列研究报道RNA干扰技术在体内外试验中均显著抑制HBV的蛋白表达和DNA复制,显示了该技术在治疗慢性乙型肝炎中具有巨大的应用前景。

紫花苜蓿MsPPR1基因的克隆及抗旱功能分析

干旱是影响植物生长发育及产量的重要环境因素,PPR(pentatricopeptide repeats)家族蛋白在植物生长发育以及胁迫响应等生理过程中都具有重要作用。本研究在中苜1号紫花苜蓿中克隆到MsPPR1,利用病毒介导的基因沉默技术和烟草异源表达,在中苜1号紫花苜蓿和烟草中验证了MsPPR1在抗旱性中的功能。结果显示,MsPPR1开放阅读框包含3213 bp,编码1070个氨基酸,相对分子量为121.65 kDa,具有多个PPR重复结构域,定位于细胞质,是典型的PPR蛋白家族成员。MsPPR1主要表达在叶中,其次是茎和根,花中最少;其表达量受自然干旱、甘露醇和脱落酸处理的诱导。通过病毒诱导基因沉默技术在紫花苜蓿中降低了MsPPR1的表达,干旱胁迫下,沉默植株更加萎蔫,相对含水量显著降低,相对电解质渗透率显著升高,显著降低了紫花苜蓿的抗旱性。在烟草中异源超表达MsPPR1,显著增强了转基因烟草的抗旱性,干旱胁迫下,丙二醛含量显著降低,脯氨酸含量增加。以上结果均表明MsPPR1是紫花苜蓿抗旱性的正调控因子,本研究为紫花苜蓿抗旱分子育种提供了候选基因。