植物病毒沉默抑制因子研究进展

RNA沉默是广泛存在于真菌﹑动物和植物中的一种特异序列降解机制。在植物中,RNA沉默是一种抵抗外界植物病毒入侵的自然机制。但是,植物病毒通常也会采取编码沉默抑制因子的相应机制来抵抗基因沉默,以便能够入侵植物。论述了主要沉默抑制因子的机制﹑特点和相关确认沉默抑制因子实验,并对沉默抑制因子的研究前景进行了展望。

转录后基因沉默的机制及其应用

确定导致转录后基因沉默的原因 ,探索在转基因植物研究中避免基因沉默的对策。方法是将转基因沉默分为转录水平的沉默和转录后水平的沉默 ,分别对RNA阈值模型、异位配对和异常RNA模型、双连RNA模型等几种导致转录后基因沉默模型的分析。结果确定了转基因沉默抑制现象和转录后基因沉默的形成机制 ,以及转录后基因沉默理论和实践意义。

非生物胁迫诱导拟南芥中防御基因表达的分子机制

以缺水处理、低温胁迫和盐胁迫的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物作为试验材料,采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR),检测水杨酸(SA)途径调控基因AtACD6和下游防御基因AtPR5的表达水平。分析结果证实了非生物胁迫处理的植物中这些防御基因的表达水平明显增加。亚硫酸盐测序结果证明非生物胁迫诱导AtACD6基因启动子区域的DNA去甲基化,导致该基因的转录激活。进一步研究证实,沉默抑制因子1(ROS1)介导的DNA去甲基化,在低温诱导AtACD6基因表达的过程中起重要作用。揭示了植物水杨酸途径防御基因应答非生物胁迫相关的分子机制中ROS1起重要作用,为探索植物适应不利环境的表观调控机制提供参考。

Sirt2抑制剂对大鼠出血性脑损伤的改善作用及其对血脑屏障通透性的影响

目的探讨沉默信息调节因子2(Sirt2)抑制剂对大鼠出血性脑损伤的改善作用及对血脑屏障通透性的影响。方法45只健康SD大鼠,取15只作为假手术组,其余30只大鼠建模成功24只,将24只出血性脑损伤模型大鼠随机分为模型组与Sirt2抑制剂组,每组12只。Sirt2抑制剂组以25 mg/kg体质量Sirt2抑制剂腹腔注射,假手术组、模型组以等体积生理盐水腹腔注射。采用神经功能缺陷评分(NSS)评估神经功能损伤程度;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;干湿法测定脑组织湿重/干重(W/D)值;苏木精-伊红(HE)染色法检测脑组织病理形态学;伊文思蓝灌注染色法检测血脑屏障通透性;蛋白质印迹法检测Sirt2、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白相对表达量。结果与模型组比较,Sirt2抑制剂组NSS评分降低(P<0.05);与假手术组比较,模型组、Sirt2抑制剂组IL-6、TNF-α水平及W/D值升高,且Sirt2抑制剂组低于模型组(P<0.05);HE染色显示,与模型组比较,Sirt2抑制剂组脑组织结构紊乱、局部出血、水肿、炎性细胞浸润等现象明显改善;与假手术组比较,模型组、Sirt2抑制剂组大脑皮层、基底节区伊文思蓝含量及Sirt2、p-NF-κB p65蛋白相对表达量升高,且Sirt2抑制剂组低于模型组(P<0.05)。结论Sirt2抑制剂可改善出血性脑损伤大鼠神经功能,减轻炎症反应、脑水肿,降低血脑屏障通透性,控制脑组织损伤,作用机制可能与抑制Sirt2/NF-κB通路有关。

AD中REST的空间分布对神经元细胞凋亡与自噬的影响

目的探讨Alzheimer病中抑制性因素1沉默作用转录因子(repressor element-1 silencing transcription,REST)的空间分布对神经元的凋亡与自噬的影响。方法 C57小鼠侧脑室注射Aβ25-35建造AD模型,以无菌生理盐水为对照,用荧光共聚焦显微镜观测REST蛋白在造模前后细胞内的定位的变化,并采用Real-Time PCR和Western印迹法检测小鼠神经元中凋亡与自噬相关基因的表达。结果荧光共聚焦显微镜观测发现AD状态下REST基因入核受阻,Real-Time PCR和Western印迹法显示促进凋亡的BAX、CASP9表达增强,而抑制凋亡的BCL2基因表达下降。自噬标志基因LC-3的表达水平也增强。结论 AD状态下REST基因入核受阻,并引起凋亡与自噬相关基因的表达。

REST/NRSF和NMDAR1在脑胶质瘤中的表达及意义

目的 探讨抑制元素-1沉默转录因子（repressor ehmem silencing transcription factor,REST）/神经元限制性沉默因子（neuron-restrictive silencer factor,NRSF）和N-甲基-D-天冬氨酸受体-1（NMDAR1）在人脑胶质瘤中的表达及意义.方法 采用免疫组织化学方法检测54例人脑胶质瘤组织标本中REST/NRSF和NMDAR1的表达.结果 54例人脑胶质瘤标本中可以观察到REST/NRSF和NMDARl的阳性表达,而且随着胶质瘤病理级别的提高阳性表达逐渐增强.在Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤中NRSF/REST阳性表达百分数分别为 2.9%,6.1%,16.2%和20.6%,NMDAR1阳性表达百分数分别为 6.2%,11.3%,19.1%和22.7%.方差分析显示,两者组间差异均具有显著性（REST/NRSF F=1 278.93,NMDAR1 F=516.69,两者均P〈0.05）.两者的表达相关性分析呈正相关（r=0.961,P〈0.05）.结论 REST/NRSF和NMDAR1可能在人脑胶质瘤的发生发展过程中起比较重要的作用,而且对于判断胶质瘤的恶性程度和预后具有一定的参考意义.

人脑胶质瘤中NRSF/REST和NMDAR1表达的差异及其与胶质瘤病理级别的关系

目的通过观察不同病理级别人脑胶质瘤中NRSF/REST和NMDAR1表达的差异,探讨其与胶质瘤病理级别的关系。方法 40例标本来自手术切除并经病理证实为胶质瘤。根据2000年WHO中枢神经系统肿瘤分类和分级标准,其中Ⅰ级10例,Ⅱ级10例,Ⅲ级10例,Ⅳ级10例。标本经石蜡包埋后经S-P免疫组织化学法染色,镜下分别观察NRSF/REST和NMDAR1在不同级别人脑胶质瘤标本中的表达。结果在胶质瘤标本中可以观察到NRSF/REST和NMDAR1的表达。NRSF/REST在Ⅰ级胶质瘤标本中的阳性表达率为3.5%,在Ⅱ级胶质瘤标本中的阳性表达率为6.4%,在Ⅲ级胶质瘤标本中的阳性表达率为14.8%,在Ⅳ级胶质瘤标本中的阳性表达率为19.5%。NMDAR1在Ⅰ级胶质瘤标本中的阳性表达率为6.3%,在Ⅱ级胶质瘤标本中的阳性表达率为10.8%,在Ⅲ级胶质瘤标本中的阳性表达率为18.2%,在Ⅳ级胶质瘤标本中的阳性表达率为22.2%,两者的表达呈正相关(P<0.05)。结论胶质瘤标本中可以观察到NRSF/REST和NMDAR1的表达,而且随着病理级别的升高,NRSF/REST和NMDAR1表达逐渐增强,不同病理级别的胶质瘤标本中REST/NRSF和NMDAR1的阳性表达率差异均有统计学意义,提示NRSF/REST和NMDAR1在胶质瘤的生长和侵袭过程中可能起一定的作用。

AD中细胞状态改变与认知障碍相关性的实验研究

目的:为什么某些呈现阿尔茨海默症解剖性和分子性特征的个体仍然会保持认知能力,对此问题我们还未完全了解。为此我们展示了小胶质细胞和抑制性因素1沉默作用转录因子(REST,repressorelement1-silencing transcription factor)在不同浓度Aβ干预下的变化情况,以探讨AD病理特征与症状产生的相关性。方法:不同浓度Aβ处理BV2细胞和N2A细胞,用荧光显微镜下观察小胶质细胞的活性变化、凋亡和自噬情况;用Western Blot检测活化标志物MHC-Ⅱ蛋白表达水平;用荧光检测共聚焦显微镜观测REST蛋白在造模前后细胞内的定位的变化及海马神经元的凋亡;并采用Realtime PCR和Western blot的方法检测小鼠神经元中凋亡与自噬相关基因的表达。同时进一步探明REST核内缺失的原因。结果:随着Aβ浓度增加,细胞形态明显改变,变性小胶质细胞比例逐渐增加,静息态小胶质细胞比例逐渐减少,同时小胶质细胞活化标志物MHC-Ⅱ蛋白表达水平增加;不同浓度Aβ处理N2A细胞,发现N2A细胞活性逐渐减低,同时凋亡的BAX、CASP9和自噬标志基因LC-3的表达水平表达增强。而抑制凋亡的BCL2基因表达下降,而REST表达水平随着Aβ浓度升高而降低。酪蛋白激酶1(caseinkinnse-1,CK1)水平随Aβ浓度升高而升高,用CK1抑制剂D4476处理即可引起REST水平显著增加;荧光共聚焦显微镜观测发现6月龄APP/PS1双转基因小鼠海马区神经元细胞已出现REST核内表达减少。结论:随着Aβ浓度的升高,出现小胶质细胞激活、REST核内减少、神经元凋亡自噬等现象,这些可能是引起突触丢失、神经元凋亡,进而导致痴呆症状的产生的潜在原因。同时REST核内减少的原因可能与其泛素化降解有关。这也进一步佐证在认知正常的人群,较高的斑块负荷会增加了其未来发生痴呆的风险。

REST及其剪切变体REST4在肿瘤中的研究进展

抑制元素l-沉默转录因子(repressor element 1-silencing transcription factor,REST)又称为神经元限制性沉默因子(neuron-restrictive silencer factor,NRSF),是神经元特异性表达的负向调控因子,存在广泛的选择性剪切现象。REST及其剪切变体REST4在不同类型肿瘤中发挥重要作用,在胶质瘤、髓母细胞瘤等神经性肿瘤中REST可作为致癌因子,而在结肠癌、肺癌、乳腺癌等上皮性肿瘤中REST作为抑癌因子发挥肿瘤抑制作用。本文就REST及其剪切变体REST4在肿瘤中的研究进行综述。

REST在宫颈鳞状细胞癌组织中表达及其对KCa3.1的影响

目的探讨抑制元件l沉默转录因子(REST)在宫颈鳞状细胞癌组织中表达及其对电导钙激活钾离子通道(KCa3. 1)的影响。方法收集宫颈鳞状细胞癌组织、癌旁组织和正常宫颈组织,采用免疫组化、qRT-PCR分别检测不同组织中REST的蛋白和mRNA表达量。Ch IP-qPCR检测REST在KCa3. 1启动子区抑制元件1(RE1)位点处富集程度。结果宫颈鳞状细胞癌、癌旁、正常宫颈组织中REST基因相对表达量分别为0. 46±0. 06、0. 89±0. 13、1. 00±0. 12;宫颈鳞状细胞癌中REST基因相对表达量较癌旁组织和正常宫颈组织分别下降48%、54%;宫颈鳞状细胞癌、癌旁、正常宫颈组织中KCa3. 1基因表达量分别为2. 14±0. 35、1. 18±0. 21、1. 00±0. 13,宫颈鳞状细胞癌中KCa3. 1基因表达量较癌旁组织和正常宫颈组织分别上升81%、114%。在宫颈鳞状细胞癌组织中REST的蛋白表达和mRNA转录水平较正常宫颈组织和癌旁组织下调(P均<0. 05)。KCa3. 1的表达量在宫颈鳞状细胞癌中较癌旁组织及正常宫颈组织增加(P均<0. 05)。REST能与KCa3. 1启动子区RE1位点结合,且宫颈鳞状细胞癌组织中REST在KCa3. 1启动子RE1位点处的富集程度低于正常宫颈组织和癌旁组织(P均<0. 05)。结论 REST通过与KCa3. 1启动子RE1位点处结合负调控KCa3. 1表达。REST表达下调降低了对KCa3. 1基因表达的抑制,导致KCa3. 1基因表达量上升,增强KCa3. 1的活性,促进宫颈鳞状细胞癌的发生发展。

miR-26b-5p通过抑制REST表达调节胶质瘤细胞生长和侵袭

目的探究miR-26b-5p通过抑制抑制元素1-沉默转录因子(repressor element 1-silencing transcrip-tion factor,REST)表达调节胶质瘤细胞生长和侵袭情况.方法逆转录-聚合酶链反应检测miR-26b-5p和REST表达水平;荧光素酶报告实验检测miR-26b-5p和REST的靶向关系;Hoechst染色检测细胞凋亡;Colony形成法检测细胞增殖;Transwell检测细胞侵袭;蛋白免疫印迹检测细胞Ki67、MMP-9、cleaved caspase-3蛋白表达水平.结果miR-26b-5p和REST存在直接靶向作用关系,与Control组比较,mimic组细胞增殖数、侵袭数和Ki67、MMP-9表达明显降低,凋亡率与cleaved caspase-3表达明显升高,inhibitor组细胞增殖数、侵袭数和Ki67、MMP-9表达明显升高,凋亡率与cleaved caspase-3表达明显降低.结论miR-26b-5p可以通过抑制对REST的表达调节胶质瘤细胞生长、侵袭、凋亡能力.

拟南芥植物中ROS1介导AtGSTF14基因的DNA去甲基化

植物中沉默抑制因子(repressor of silencing 1, ROS1)能够主动去除DNA甲基化,并负调控RNA介导的DNA去甲基化(RdDM)途径。本试验重点研究非生物胁迫诱导抗逆基因AtGSTF14表达的分子机制。定量PCR (quantitative PCR, qPCR)检测结果表明非生物胁迫处理后拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物中AtGSTF14基因表达显著上调。DNA测序结果证明非生物胁迫诱导AtGSTF14基因启动子区域DNA去甲基化。研究证实ROS1介导的DNA去甲基化在低温胁迫诱导AtGSTF14基因转录表达的过程中起重要作用,为植物适应环境的表观调控机制探索提供了研究基础。

拟南芥中AtACO3基因启动子DNA甲基化的调控机制

RNA介导的DNA甲基化途径(RdDM)在基因表达调控过程中起重要作用。沉默抑制因子(repressor of silencing 1,ROS1)能负调控RdDM途径。定量RT-PCR(quantitative RT-PCR,RT-qPCR)被利用检测拟南芥(Arabidopsis thaliana)中ABA途径相关基因AtACO3表达水平,结果表明非生物胁迫诱导后AtACO3表达水平显著上调。重亚硫酸盐测序结果证明非生物胁迫诱导该基因启动子重复序列的DNA去甲基化,并导致该基因的转录激活。进一步研究证实ROS1在诱导该基因启动子DNA去甲基化的过程中起作用。本研究揭示了非生物胁迫诱导逆境响应基因AtACO3表达的分子机制,为探索植物适应非生物胁迫的表观遗传调控机制提供了科学依据。

REST／CoREST对TBI后皮层神经元轴突修复作用的体外研究

目的探讨抑制元素-1沉默转录因子（REST1、REST辅助抑制因子（CoREST）对创伤性脑损伤（TBI）后皮层神经元轴突再生及修复的影响。方法（1）体外原代培养C57BL／6胎鼠大脑皮层神经元，实时定量PCR（q．PCR）检测神经元培养1d、3d、5d、7d、9d、11d后微小RNA．124（miR-124）的表达；（2）将培养5d后神经元分为miR-124模拟物组、空白对照组、miR-124抑制物组，分别转染miR-124模拟物、无义对照序列、miR．124抑制物。转染后0h、6h、12h、24h、48h、72h采用q-PCR检测神经元miR-124的表达；（3）将培养7d后神经元分为空白对照组、氧糖剥夺（OGD）模型组、上调miR-124＋OGD模型组、下调miR-124＋OGD模型组，后2组细胞分别转染miR-124模拟物和miR．124抑制物。转染48h后3组细胞均制备OGD模型，q-PCR检测0GD处理后0h、6h、12h、24h、48h、72h各组神经元miR．124的表达：Westernblotting检测OGD处理后48h神经元生长相关蛋白43（GAP．431、REST、CoREST的表达；免疫荧光染色检测OGD处理后48h神经元REST、CoREST的表达。结果（1）皮层神经元培养1、3、5、7d后miR-124的表达逐渐增高，皮层神经元培养7、9、11d后miR．124的表达逐渐降低，差异均有统计学意义（p〈0．05）；（2）转染后24、48hmiR-124抑制物组神经元miR-124的表达低于空白对照组。转染后12h、24h、48h、72hmiR-124模拟物组神经元miR-124的表达高于空白对照组，差异均有统计学意义（氏0．05）。其中转染后48h神经元miR-124的表达最高。（3）q．PCR检测显示，0GD处理后12h、24h、48h、72hOGD模型组神经元miR-124的表达高于空白对照组，差异有统计学意义（p〈0．05），其中OGD处理后48h最高；OGD处理后0h、6h、12h、24h、48h、72h．上调miR-124＋OGD模型组神经元miR．124的表达高于空白对照组和0GD模型组，差异有统计学意义（P〈0．05），其中OGD处理后48h最高；Westemblotting检测显示空白对照组，OGD模型组、下调miR-124＋OGD模型组皮层神经元GAP-43、CoREST的表达依次增高，REST的表达依次降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。上调miR-124＋OGD模型组神经元GAP．43、CoREST的表达低于0GD模型组，REST的表达高于OGD模型组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。免疫荧光染色检测结果与Westernblotting检测结果一致。结论REST、CoREST作为-对调节子．可能是TBI后神经元轴突修复及再生的关键因素。