基于SIRT1/SOX2信号通路探究西黄丸抗乳腺癌作用及机制

[目的]基于沉默调节蛋白1(SIRT1)/性别决定区Y框蛋白2(SOX2)信号通路探究西黄丸抗乳腺癌作用及机制。[方法]将MDA-MB-231细胞分为对照组、西黄丸低剂量组(5 g/L)、西黄丸中剂量组(7.5 g/L)、西黄丸高剂量组(15 g/L)、SIRT1激活剂(SRT 1720)组(6μmol/L)、西黄丸高剂量+SRT 1720组(15 g/L+6μmol/L);CCK-8法和平板克隆实验检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移;Transwell法检测细胞侵袭;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、SIRT1、SOX2蛋白表达;体内移植瘤实验检测各组裸鼠肿瘤体积、质量及PCNA、MMP-2、MMP-9、SIRT1、SOX2蛋白表达。[结果]西黄丸可抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及裸鼠体内移植瘤的生长,且呈剂量依赖性;SIRT1激活剂SRT 1720促进MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及裸鼠体内移植瘤的生长;高剂量西黄丸加SIRT1激活剂组可以减弱高剂量西黄丸对MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及裸鼠体内移植瘤的生长的抑制作用;同时西黄丸可呈剂量依赖性地抑制MDA-MB-231细胞及裸鼠移植瘤中SIRT1、SOX2蛋白表达,抑制SIRT1/SOX2信号通路活性,并通过降低PCNA、MMP-2、MMP-9表达来抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及裸鼠体内移植瘤的生长。[结论]西黄丸可能通过抑制SIRT1/SOX2信号通路抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及裸鼠体内移植瘤生长。

SOX9通过转化生长因子β信号通路调节角膜内皮损伤后内皮-间质转化过程

目的探究性别决定区Y框蛋白9(sex-determining region Y-box protein 9,SOX9)是否会调控角膜内皮细胞损伤后的角膜上皮-间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)过程及具体机制。方法转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低人角膜内皮细胞B4G12中SOX9的表达,使用甲萘醌构建体外B4G12细胞损伤模型,设4个分组:si-NC组(转染siRNA-阴性对照)、si-SOX9组(转染siRNA-SOX9)、si-NC+甲萘醌组(转染siRNA-阴性对照后添加外源性甲萘醌做损伤处理)、si-SOX9+甲萘醌组(转染siRNA-SOX9后添加外源性甲萘醌做损伤处理)。通过实时荧光逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western blot检测各组细胞中EndMT关键因子Snail家族转录抑制因子2(snail family transcriptional repressor 2,SNAIL2)及相关信号通路关键因子表达变化,阐明SOX9调控EndMT过程的功能和机制。结果转染siRNA-SOX9敲低细胞SOX9表达后,给予甲萘醌细胞损伤处理,观察到细胞中SNAIL2的表达会随SOX9的敲低而降低,同时观察到转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)信号通路中SNAIL2的上游关键因子Smad2/Smad3的表达也随着SOX9的敲低而降低。结论SOX9通过TGF-β信号通路调控角膜内皮损伤后EndMT过程。

黄芩总黄酮对人骨关节炎软骨细胞增殖凋亡及COL10A1/SOX9信号通路的影响

目的:探讨黄芩总黄酮对人骨关节炎(OA)软骨细胞增殖凋亡及X型胶原蛋白α1链(COL10A1)/性别决定区Y框蛋白9(SOX9)信号通路的影响。方法:从5例行膝关节置换术的OA患者的关节软骨分离软骨细胞,用甲苯胺蓝染色进行鉴定。实验分为对照组、黄芩总黄酮低、中、高剂量组(25,50,100 mg·L-1)和塞来昔布组(9 mg·L-1)。噻唑蓝(MTT)法测定人OA软骨细胞增殖情况,流式细胞仪测定细胞凋亡水平,免疫印迹法检测人OA软骨细胞中COL10A1、SOX9、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白水平。结果:人OA软骨细胞附着于培养皿后呈多边形或长条形,甲苯胺蓝染色可见OA软骨细胞胞浆以蓝紫色为主,异染颗粒散布于细胞间或细胞周围;与对照组比较,黄芩总黄酮低、中、高剂量组和塞来昔布组人OA软骨细胞增殖率、COL10A1、SOX9、Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax水平升高,凋亡率、ERK1/2和Bax蛋白水平降低(P<0.05);随着黄芩总黄酮浓度的增加,黄芩总黄酮各剂量组人OA软骨细胞增殖率、COL10A1、SOX9、Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax水平逐渐升高,凋亡率、ERK1/2和Bax蛋白水平逐渐降低(P<0.05);黄芩总黄酮高剂量组与塞来昔布组作用相似,上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:黄芩总黄酮可能通过激活COL10A1/SOX9信号通路,抑制人OA软骨细胞凋亡,促进OA软骨细胞增殖。

SOX7靶向ERK1/2/PD-L1通路抑制结直肠癌血管生成

目的探讨性别决定区Y框蛋白7(SOX7)对结直肠癌血管生成的影响及潜在作用机制。方法应用免疫荧光检测结直肠癌患者组织样本中SOX7表达水平,之后通过裸鼠、转染SOX7 mimic的人结直肠癌细胞系SW480细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养进一步研究。用Western-blot验证SOX7与ERK1/2/PD-L1对结直肠癌细胞的相关蛋白表达的影响。用CCK8检测SOX7与ERK1/2/PD-L1对HUVEC增殖的影响。通过体外内皮细胞成管实验测定SOX7与ERK1/2/PD-L1对肿瘤血管生成的影响。结果SOX7在人结直肠癌组织中表达被抑制(P<0.01),同时SOX7的过表达抑制了小鼠体内肿瘤生长(P<0.01)。SW480细胞中SOX7的过表达抑制了ERK1/2、c-Jun的表达,并在ERK1/2的激动剂Senkyunolide I的作用下上调了SW480细胞的ERK1/2、c-Jun蛋白表达(P<0.01),逆转了SOX7对SW480细胞中ERK1/2、c-Jun蛋白表达的影响(P<0.01)。HUVEC中SOX7抑制了PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,Senkyunolide I上调了HUVEC的PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,并逆转了SOX7对HUVEC中上述相关蛋白表达的影响(P<0.01)。PD-1/PD-L1 Inhibitor 3抑制了PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,SOX7过表达在PD-1/PD-L1 Inhibitor 3的影响下并没有表现出抑制作用。CCK8实验结果显示SOX7过表达显著抑制了HUVEC的增殖能力,Senkyunolide I作用下的两组HUVEC增殖能力较SOX7 NC组与SOX7 mimic组明显上升,PD-1/PD-L1 Inhibitor 3作用下的两组HUVEC增殖能力较SOX7 NC组与SOX7 mimic组明显下降,以上均有明显统计学差异(P<0.01)。成管实验结果显示SOX7过表达抑制了HUVEC的血管生成,Senkyunolide I强烈加速了血管生成,而PD-1/PD-L1 Inhibitor 3血管生成则被显著抑制,以上均有明显统计学差异(P<0.01)。结论SOX7通过ERK1/2/PD-L1通路抑制结直肠肿瘤的增殖和血管生成,SOX7可能是晚期CRC患者临床治疗中潜在的抗血管生成靶点。

转录辅激活因子Mediator 1调控小鼠皮肤毛发再生的作用机制研究

目的探讨转录辅激活因子Mediator 1(Med1)对小鼠皮肤毛发再生的影响及可能机制。方法将C57BL/6J品系来源的Med1flox/flox小鼠与K14-Cre小鼠交配,通过Cre-Loxp系统获得Med1表皮特异性敲除小鼠,即表达K14-Cre的Med1flox/flox小鼠(敲除组),不表达K14-Cre的Med1flox/flox小鼠即为对照组,每组3只,共同饲养8周左右行背部脱毛实验,连续12 d观察毛发再生情况。12 d后,处死两组小鼠并切取其背部脱毛和未脱毛皮肤组织,提取组织总RNA,实时定量PCR检测毛发角蛋白基因、维生素D受体/β联蛋白通路相关基因、毛囊增殖与静息状态维持相关基因的表达。制备小鼠背部脱毛和未脱毛皮肤组织石蜡切片,免疫荧光染色检测小鼠皮肤毛囊隆突部位干细胞数量。组间比较采用两独立样本t检验。结果脱毛后0~12 d,与对照组相比,敲除组小鼠脱毛区皮肤毛发再生延迟。实时定量PCR检测显示,敲除组脱毛皮肤组织中毛发角蛋白基因Ha1、Krt2-16及维生素D受体/β联蛋白通路相关基因S100a3、Dlx3、Tubb3和毛囊增殖与静息状态维持相关基因Lhx2、Sox9、Nfatc1 mRNA相对表达量(22.09±12.32、2.07±0.20、0.02±0.01、12.36±2.12、1.75±0.46、0.39±0.02、4.42±0.76、0.44±0.07)均显著低于对照组(70.53±9.46、7.76±0.49、0.05±0.01、26.16±2.96、2.60±0.14、0.71±0.09、11.93±0.42、0.75±0.04;t值分别为5.40、18.64、3.89、6.57、3.04、6.10、15.03、6.18,均P<0.05)。免疫荧光染色显示,无论在脱毛还是未脱毛皮肤组织中,敲除组毛囊隆突部位CD34+K15+毛囊干细胞数量均远低于对照组。结论Med1基因敲除可能通过下调维生素D受体/β联蛋白通路下游基因及毛囊增殖与静息状态维持相关基因Sox9、Nfatc1、Lhx2的表达,减少毛囊干细胞数量,导致毛囊分化障碍,毛发再生延迟。