沙蚕蛋白酶高效降解变异新冠病毒S蛋白作用与S蛋白的生化特性分析

从今年3月起,WHO不再将新冠病毒感染,列为全球关注的灾害性卫生事件,但是新感染病例依然存在,其原因与病毒基因组经常突变,引起特异抗体失效和免疫逃逸有关,同时特异性治疗药物依然有限。病毒S蛋白是病毒感染宿主细胞的关键结构,S蛋白质突变,导致其结构生化特征和功能等随之变化。我们曾分析了世卫组织(WHO)认定的野生型和5种关切变异毒株的生化特征,并研究证实了日本刺沙蚕碱性丝氨酸蛋白酶(ASP_(NJ))可以高效与相对特异地降解野生型病毒S蛋白。本文分析了Omicron变异毒株(BA.2、BF.7、XBB.1)S蛋白质与ASP_(NJ)相关的生物化学特征,并经SDS-PAGE分析,直观证实了ASP_(NJ)可以高效降解这些S蛋白质,但变异株S蛋白抵抗ASP_(NJ)消化能力更强一些。本文还报告了ASP_(NJ)对野生型假病毒的影响,初步结果显示,ASP_(NJ)可能具有减少野生型假病毒感染293T-CAE2受体细胞的作用。这些结果表明,ASP_(NJ)有可能成为一种新工具酶,用于研究新冠病毒的结构与功能。

一组新的沙蚕蛋白酶同工酶的分离纯化与鉴定

分离纯化一组新的沙蚕蛋白酶同工酶，并对其性质进行鉴定．用硫酸铵盐析、凝胶过滤层析和疏水层析技术从沙蚕中分离得到了沙蚕蛋白酶，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、高效液相色谱（HPLC）、等电聚焦电泳（IEF）和质谱分析（MS）鉴定，发现沙蚕蛋白酶由3个组分组成，均有纤溶活性，其等电点为3．5～4．5，分子量分别为29248．75、29007．66、28954．17，肽指纹图谱分析发现，它们均为未知的新蛋白质，其中2个组分结构相似，具有较高的同源性，与另1个有不同．用抗原抗体反应鉴定其免疫原性，发现3个组分中有2个组分具有相同的免疫原性，另1个组分与2者不同．但3者具有相同的抗原决定簇，证明沙蚕蛋白酶由2个同工酶组成．以4种专一性的抑制剂对其进行抑制，检测酶的活性确定其酶学性质，发现其反应的适宜温度为40℃～50℃、适宜pH值为8～9．沙蚕蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶．

沙蚕蛋白酶对血小板聚集及血液流变学的影响

目的:探讨沙蚕蛋白酶的抗血小板聚集作用及对血液流变学的影响。方法:利用二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸及胶原诱导大鼠血小板聚集,测定血小板最大聚集率;采用股静脉注射高分子右旋糖酐建立大鼠高黏滞血症模型,检测血液流变学指标。结果:沙蚕蛋白酶可抑制诱导剂ADP,花生四烯酸及胶原引起的大鼠血小板聚集,降低其最大聚集率;可降低大鼠全血黏度,对血浆黏度、红细胞沉降率及红细胞压积均无影响。结论:沙蚕蛋白酶具有显著的血小板聚集抑制作用及改善血液流变学特性。

沙蚕不同蛋白酶酶解产物滋味特征及聚类分析研究

目的研究沙蚕不同酶解产物中氨基酸和呈味核苷酸的含量、组成与呈味效果差异。方法以酱油粉为对照,采用味道强度值、味精当量、主成分分析法、聚类分析法进行分析和综合评价。结果沙蚕不同蛋白酶酶解产物中游离氨基酸总量在(90.84±1.12)~(151.25±0.95)mg/g之间;风味蛋白酶酶解产物的游离氨基酸和呈味氨基酸含量最高;胰蛋白酶组的味精当量值远高于酱油粉组;各组氨基酸对滋味有较大贡献,风味、胰蛋白酶组中谷氨酸的味道强度值与酱油粉组中该值接近,分别为37.13和35.40 mg/g。提取了4个主成分,累计方差贡献率达92.537%,较好地反应了酶解产物中游离氨基酸的综合信息,风味蛋白酶组综合得分最高,基于电子舌的滋味轮廓也支撑了这一结论。采用聚类分析将实验组分为4类,较直观地反映了不同酶解产物间的差异。结论风味蛋白酶和胰蛋白酶酶解沙蚕的产物游离氨基酸品质较好,且鲜味氨基酸含量和呈味核苷酸含量较高,可开发呈味基料。

沙蚕蛋白酶的荧光标记及细胞摄取机制研究

该文利用FITC对沙蚕蛋白酶(NAP)进行荧光标记,并通过薄层色谱法、红外光谱法、紫外光谱法及荧光光谱法对标记物进行表征,紫外分光光度法计算标记度。通过测定NAP与FITCNAP的酶促反应动力学参数来比较NAP在标记前后的活性,同时应用MTT法考察NAP标记前后对NCI-H1299细胞毒性的影响。流式细胞术研究NCI-H1299细胞摄取FITC-NAP的机制,荧光显微镜定性观察NCI-H1299细胞对FITC-NAP的摄取。结果表明,每分子标记物约含1.78分子FITC,其最佳荧光激发波长为490 nm、发射波长为515 nm;荧光标记后NAP的活性未受到显著影响; NCI-H1299细胞对FITC-NAP的摄取与药物浓度、作用时间呈正相关;氧化苯砷组的荧光强度低于FITC-NAP组且有极显著差异(P<0.01),因此NAP的摄取机制为内吞。进一步研究发现, NCI-H1299细胞摄取NAP受到网格蛋白依赖性内吞和小窝/脂筏蛋白介导的内吞共同作用。荧光显微镜观察发现,随着时间的增加,更多的细胞摄入FITC-NAP,且主要分布在细胞膜及细胞质中,细胞核中未见分布。